柚皮苷和柚皮素對(duì)克拉霉素經(jīng)大鼠肝微粒體代謝的影響

謝鏜寧 蘇薇薇 王永剛 吳 灝 彭 維 李沛波

中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510275

細(xì)胞色素P450（CYP450）酶是肝臟和腸中最為重要的Ⅰ相代謝酶，具有可誘導(dǎo)性和可抑制性。因此，對(duì)CYP450 酶活性的抑制或誘導(dǎo)是引發(fā)藥物相互作用的常見(jiàn)機(jī)制。研究證實(shí)，克拉霉素主要由CYP3A 酶代謝[10]。目前，關(guān)于柚皮苷和柚皮素是否會(huì)通過(guò)影響CYP450 酶的活性來(lái)影響克拉霉素的代謝，鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用體外溫孵法評(píng)估柚皮苷和柚皮素對(duì)克拉霉素經(jīng)大鼠肝微粒體代謝的影響，以期為臨床安全合理用藥提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

Wistar 大鼠，7 周齡，雄性，體重200～220 g，無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)，由廣東省醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002。飼養(yǎng)于中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物房，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（粵）2004-0020。動(dòng)物試驗(yàn)流程遵循中山大學(xué)有關(guān)試驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南，并經(jīng)試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀（HPLC，型號(hào)：DIONEX P680 UVD，170 U 紫外檢測(cè)器，ASI-100 自動(dòng)進(jìn)樣器），Chromeleon Client Programm 軟件（DIONEX，美國(guó)）；柚皮苷（純度>98%，委托廣東環(huán)球制藥有限公司生產(chǎn)）；柚皮素（Sigma，純度>98%，批號(hào)：083K1328）；克拉霉素（中國(guó)生物制品檢定所，批號(hào)：130558-200501）；羅紅霉素（中國(guó)生物制品檢定所，批號(hào)：130557-200502）；還原型輔酶Ⅱ四鈉（NADPH，廣州威佳生物科技有限公司，批號(hào)：2009/08）；BCA-100 蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒（上海申能博彩生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

柚皮苷和柚皮素標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的柚皮苷對(duì)照品5.83 mg 和柚皮素對(duì)照品2.86 mg，分別置于10 mL 容量瓶中，加250 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解，用0.1 mol/L 三羥甲基氨基甲烷（Tris）-KCl 溶液定容，配制成1 mmol/L 的母液，再稀釋成100、10 μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，備用。

克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密稱(chēng)取克拉霉素7.48 mg，置于10 mL 容量瓶中，加250 μL DMSO 溶解，用0.1 mol/L Tris-KCl 溶液定容，配制成濃度為1 mmol/L的母液，備用。

在去云南西雙版納野象谷之前，我腦海里對(duì)大象的印象是這樣的：身體龐大，食量驚人。但在參觀野象谷之后，我對(duì)大象有了更全面的了解。

羅紅霉素內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱(chēng)取羅紅霉素4.44 mg，置于5 mL 容量瓶中，加50%甲醇溶解，用0.1 mol/L Tris-KCl 溶液定容，配制成0.888 mg/mL 的溶液，備用。

1.3.2 大鼠肝微粒體制備

按照參考文獻(xiàn)[11]的方法制備肝微粒體。采用BCA-100 蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒測(cè)定肝微粒體蛋白含量為（1.243±0.076）mg/mL，用Omura 法測(cè)定CYP450 酶的含量為（1.85±0.05）nmol/mg。

1.3.3 體外孵育條件確定

取肝微粒體，用TMS 溶液（Tris 6.05 g、MgCl20.609 g、蔗糖68.4 g 加0.5 L 水溶解，用濃鹽酸調(diào)pH 至7.4 后，補(bǔ)充水至1 L）稀釋成蛋白濃度為1.0 mg/mL的混懸液，取此混懸液150 μL，加入克拉霉素溶液中混勻，于37℃孵育5 min。用含NADPH 的1% NaHCO3溶液20 μL（終濃度1 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，終體積為250 μL，于37℃下孵育一定時(shí)間后，放入冰浴終止反應(yīng)，以供測(cè)定。

1.3.4 克拉霉素測(cè)定方法學(xué)考察

1.3.4.1 色譜條件 色譜柱為依利特Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.069 mol/L KH2PO4水溶液（36∶64），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

1.3.4.2 樣品處理 100 μL 樣品中加入10 μL 濃度為0.888 mg/mL 的羅紅霉素溶液，加入200 μL 甲醇，渦旋混合2 min 后，12 000 r/min 離心10 min（4℃），吸取20 μL 進(jìn)樣測(cè)定。

1.3.4.3 專(zhuān)屬性研究 分別配制3 種溶液各150 μL，其中，一份為失活后的肝微粒體，作為空白體系；一份為失活后的肝微粒體加入克拉霉素及內(nèi)標(biāo)羅紅霉素；一份為肝微粒體加入克拉霉素。分別孵育后按“1.3.4.2”項(xiàng)下操作并測(cè)定，觀察大鼠肝微粒體中的雜質(zhì)對(duì)藥物檢測(cè)是否存在干擾。

1.3.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，加入滅活肝微粒體配制成濃度為5、25、50、75、100 及125 μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液150 μL，按“1.3.4.2”項(xiàng)下操作并測(cè)定。以待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.5 準(zhǔn)確度及精密度試驗(yàn) 取肝微粒體和Tris-KCl溶液置于離心管中，分別加入克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配成濃度為10、50 和100 μmol/L 的質(zhì)控樣品溶液，按“1.3.4.2”項(xiàng)下操作并測(cè)定，每種濃度重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算準(zhǔn)確度及精密度。

1.3.4.6 回收率試驗(yàn) 取肝微粒體和Tris-KCl 溶液置于離心管中，分別加入克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配成濃度為10、50 及100 μmol/L 的溶液，平行6 份，按“1.3.4.2”項(xiàng)下操作并測(cè)定；另配制克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)定，通過(guò)二者的比值計(jì)算回收率。

1.3.5 代謝時(shí)間-濃度變化研究

分別制備10、50 及120 μmol/L 的克拉霉素 溶液，按上述方法孵育15、30、45、60 及90 min 后，按“1.3.4.2”項(xiàng)下操作后測(cè)定剩余克拉霉素的量，明確代謝時(shí)間-濃度變化關(guān)系，以確定最佳孵育時(shí)間。

1.3.6 克拉霉素在大鼠肝微粒體中的代謝動(dòng)力學(xué)研究

分別制備10、20、40、60、80、100 和120 μmol/L 的克拉霉素溶液，在肝微粒中孵育60 min 后，按“1.3.4.2”項(xiàng)下操作，用HPLC 測(cè)定剩余克拉霉素的含量。根據(jù)Lineweaver-Burk 方程式1/V=Km/（Vmax×[S]）+1/Vmax，以底物濃度的倒數(shù)1/[S]對(duì)反應(yīng)速度的倒數(shù)1/V 進(jìn)行線性回歸，截距的倒數(shù)即為最大反應(yīng)速度（Vmax），斜率乘以Vmax即為米氏常數(shù)（Km）。

1.3.7 柚皮苷和柚皮素對(duì)克拉霉素在大鼠肝微粒體中代謝的影響

采用一系列濃度的柚皮苷和柚皮素溶液（180.00、90.00、30.00、10.00、3.30、1.10、0.33 及0.11 μmol/L）與克拉霉素溶液進(jìn)行共孵育60 min 后，按“1.3.4.2”項(xiàng)下操作，用HPLC 測(cè)定剩余克拉霉素的含量。另設(shè)空白對(duì)照，以空白對(duì)照組代謝量為100%，計(jì)算柚皮苷和柚皮素對(duì)克拉霉素經(jīng)大鼠肝微粒體代謝的相對(duì)抑制率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 專(zhuān)屬性研究

在本色譜條件下，克拉霉素的保留時(shí)間為12.5 min左右，空白體系在克拉霉素及羅紅霉素保留時(shí)間內(nèi)無(wú)雜質(zhì)峰干擾，本檢測(cè)方法專(zhuān)屬性良好。見(jiàn)圖1。

圖1 專(zhuān)屬性研究

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

結(jié)果顯示，在5～125 μmol/L 的濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0062 X -0.0132，R2=0.9994。

2.3 準(zhǔn)確度、精密度和回收率

在本色譜條件下，測(cè)定的克拉霉素含量，準(zhǔn)確度及精密度的偏差值均＜±15%，回收率均在90%～110%范圍內(nèi)，符合生物樣品分析方法的要求。見(jiàn)表1。

表1 克拉霉素的精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 克拉霉素代謝時(shí)間-濃度變化

當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到60 min，克拉霉素基本達(dá)到代謝平臺(tái)期，符合試驗(yàn)要求。在方法學(xué)驗(yàn)證及樣品測(cè)定試驗(yàn)中，選擇60 min 作為孵育體系的代謝時(shí)間。見(jiàn)表2。

表2 克拉霉素代謝時(shí)間-濃度變化（n=3）

2.5 克拉霉素酶動(dòng)力學(xué)結(jié)果

根據(jù)Lineweaver-Burk 方程式得到曲線方程為Y=78195 X+1008（X 為底物濃度的倒數(shù)，Y 為反應(yīng)速度的倒數(shù)，R2=0.9947），Vmax為0.59 nmol/（min·mg），Km=77.57 μmol/L。確定80 μmol/L 作為克拉霉素的代謝反應(yīng)的底物濃度。

2.6 柚皮苷和柚皮素對(duì)克拉霉素在大鼠肝微粒體中代謝的影響

與空白對(duì)照組比較，各劑量組的柚皮苷和柚皮素對(duì)克拉霉素在大鼠肝微粒體中的代謝量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。見(jiàn)表3。

表3 柚皮苷和柚皮素對(duì)克拉霉素在大鼠肝微粒體中代謝的影響（n=3）

3 討論

近年來(lái)，柚皮苷因其廣泛的藥理活性而受到關(guān)注，大量研究表明，柚皮苷或柚皮素具有抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、改善神經(jīng)功能障礙、改善糖脂代謝紊亂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[12-15]。目前，關(guān)于柚皮苷對(duì)CYP450 酶活性的影響，多集中于CYP3A 酶，且文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論不一致。Edwards 等[16]的研究顯示，葡萄柚汁中抑制CYP3A 酶活性的主要成分不是柚皮苷和柚皮素；Kim 等[17]的研究顯示，柚皮苷可能通過(guò)抑制CYP3A 酶活性而減少維拉帕米在家兔體內(nèi)的代謝；Choi 等[18]的研究顯示，柚皮苷可能通過(guò)抑制CYP3A酶活性和P-糖蛋白而提高他莫西芬在大鼠體內(nèi)的生物利用度。可見(jiàn)，柚皮苷對(duì)CYP3A 酶活性的影響尚無(wú)統(tǒng)一定論。

克拉霉素在體內(nèi)主要由CYP3A4 酶代謝[10]，也能抑制CYP3A4 酶[19]和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1 和1B3 的活性[20]。目前，關(guān)于克拉霉素的藥物相互作用方面，大多研究的是克拉霉素對(duì)其他藥物的影響。

本研究結(jié)果顯示，在5～125 μmol/L 的濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0062 X -0.0132，R2=0.9994。說(shuō)明在該線性范圍內(nèi)，克拉霉素的濃度與色譜峰面積之間線性關(guān)系良好。在本色譜條件下，測(cè)定的克拉霉素含量，準(zhǔn)確度及精密度的偏差值均＜±15%，回收率均在90%～110%范圍內(nèi)，符合生物樣品分析方法的要求。說(shuō)明該測(cè)定方法的準(zhǔn)確性、精密度、回收率良好，適用于該體系克拉霉素的檢測(cè)。當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到60 min，克拉霉素基本達(dá)到代謝平臺(tái)期，符合試驗(yàn)要求。因此，在方法學(xué)驗(yàn)證及樣品測(cè)定試驗(yàn)中，選擇60 min 作為孵育體系的代謝時(shí)間。根據(jù)Lineweaver-Burk 方程式得到曲線方程為Y=78195 X+1008（X 為底物濃度的倒數(shù)，Y 為反應(yīng)速度的倒數(shù)，R2=0.9947），Vmax為0.59 nmol/（min·mg），Km=77.57 μmol/L。因此，確定80 μmol/L 作為克拉霉素的代謝反應(yīng)的底物濃度。柚皮苷和柚皮素濃度0.11～180 μmol/L 的范圍內(nèi)對(duì)克拉霉素在大鼠肝微粒體中的代謝無(wú)明顯影響。提示柚皮苷和柚皮素不影響克拉霉素在大鼠肝微粒體中的代謝。