崗梅清瘟敗毒合劑的提取工藝優化及薄層色譜鑒別方法▲

金雪峰 劉 元 陳 英

(1 廣西壯族自治區人民醫院臨床藥學科，南寧市 530021，電子郵箱：jinxuefeng_521111@126.com；2 廣西中醫藥研究院，南寧市 530022)

手足口病是由多種腸道病毒引起的傳染性疾病，以嬰幼兒發病為主。該病以發熱和手、足、口腔等部位出現皮疹或皰疹為主要特征，屬自限性疾病，嚴重威脅人類尤其是兒童的健康[1-2]。引起手足口病的腸道病毒主要包括新型腸道病毒71型和A組柯薩奇病毒等[3-4]。對于該疾病的治療，現代醫學主要以抗病毒、預防感染為主，尚無特效藥物和疫苗。因此，研發一種能夠快速緩解病情、特異性有效治療手足口病的新型藥物制劑，是一個亟待解決的國際性難題。

壯醫理論提出人體因毒發病，因氣虛受有形無形之毒侵犯，應以調氣、解毒、補虛為原則，采用藥物解毒功效以達治療目的[5]。崗梅清瘟敗毒合劑是廣西壯族自治區人民醫院根據廣西地方民族經驗方，經篩選后研制的中藥民族藥制劑，主要由生石膏、麻黃、山芝麻、梅葉冬青、黃芩、貫眾、杏仁、桔梗、柴胡等組成，具有清熱宣肺、透疹生津之功效，用于證屬風溫邪在肺衛證及風溫邪熱壅盛證的手足口病，亦可用于感冒證屬風熱證者。本文通過正交實驗法確定其最佳提取工藝，此外采用薄層色譜法定性鑒別了處方中的黃芩、粉葛、柴胡，旨在控制本品質量、確保其療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 YOKO-ZS紫外分析攝影儀、YOKO-BD薄層電動點樣儀均購自武漢藥科新技術開發公司，LC3000I型高效液相色譜儀、UV3000紫外檢測器、CXTH-3000色譜工作站購自北京創新通恒科技有限公司。

1.2 試藥 乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。麻黃堿對照品(中國藥品生物制品檢定研究院提供，供含量測定用，批號：110737-201516)。黃芩苷對照品(批號：111754-200601)、葛根素對照品(批號：110756-200110)、柴胡對照藥材(批號：121465-200501)均購自中國藥品生物制品檢定所。崗梅清瘟敗毒合劑由廣西壯族自治區人民醫院提供(批號：180729、180730、180731)。

2 方法與結果

2.1 提取工藝優化

2.1.1 因素水平的確定：選取藥材浸泡時間(A)、提取溶劑量(B)、提取次數(C)、提取時間(D)作為水提的主要影響因素。設定藥材浸泡時間為0 h、0.5 h、1.0 h 3個水平，提取溶劑量為加水量的8/6/6倍、10/8/8倍、12/10/10倍3個水平，提取次數為1次、2次、3次3個水平，提取時間為1 h、1.5 h、2 h 3個水平。采用L9(34)正交試驗表安排正交試驗，因素水平見表1。

表1 水提工藝條件正交試驗因素水平表

2.1.2 提取方法：根據工藝要求，稱取1/2個處方量藥材9份，每份藥材含石膏30 g、麻黃7.5 g、黃芩7.5 g、山芝麻10 g、崗梅根10 g、貫眾10 g、杏仁7.5 g、桔梗10 g、柴胡12.5 g、蘆根10 g、粉葛20 g、薏苡仁20 g、蒼術10 g、淡竹葉7.5 g、炙甘草6 g(均購自南寧生源中藥飲片有限責任公司)；分別根據L9(34)正交表(見表2)內的9個試驗列號及條件進行，將每次試驗的提取液濾過，合并濾液，濾液濃縮至500 mL，靜置24 h，濾過，加入用適量熱水煮沸溶解的羥苯乙酯0.3 g，加水調整總量至500 mL，備用。

2.1.3 麻黃堿含量的測定：精密稱取麻黃堿對照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得對照品溶液。取合劑5 mL，置具塞錐形量瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理1 h(200 W，40 kHz)，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足缺失重量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。分別吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL進樣，按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則[6]，測定每個實驗樣品提取所得麻黃堿的含量，結果見表2～3。

表2 L9(34)正交試驗方案及結果

表3 正交試驗方差分析結果

2.1.4 測定結果及提取條件的確定：各因素R值大小為C>D>B>A，由此可知，因素C是影響提取工藝的重要因素，因素B、D是次要因素，因素A是更次要的因素。再結合各因素K值進行分析，確定提取的最佳工藝條件為A1B1C2D2：(1)浸泡時間(A)，三者K值相差不大，為節省時間，故定浸泡時間為0 h；(2)提取溶劑量(B)，8/6/6倍的K值最高，且節省溶劑，故定提取溶劑量為加水量的8/6/6倍；(3)提取次數(C)，盡管提取3次的K值最高，但與提取2次相差不大，為節省時間、溶劑，大生產可不予以考慮，故定提取次數為2次；(4)提取時間(D)，提取2 h的K值最高，但與1～5 h獲得總量基本一致，故定提取時間為1.5 h。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1黃芩的鑒別：取2.1.2中制備的崗梅清瘟敗毒合劑30 mL，用鹽酸調節pH值至1～2，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液(水溶液備用)，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部中有關薄層色譜法的步驟[6]進行試驗，吸取供試品溶液3～5 μL，對照藥材溶液3～5 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(4 ∶1 ∶10)為展開劑展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液,105℃加熱至斑點顯色清晰，熱風吹至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾，見圖1。

圖1 黃芩苷薄層色譜圖

注：1為崗梅清瘟敗毒合劑180729供試品；2為崗梅清瘟敗毒合劑180730供試品；3為黃芩苷對照品；4為缺黃芩陰性對照；5為崗梅清瘟敗毒合劑180731供試品。

2.2.2 柴胡的鑒別：取2.1.2中制備的崗梅清瘟敗毒合劑30 mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次25 mL，棄去乙酸乙酯液；水液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次25 mL，棄去洗滌液；蒸干正丁醇液，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取柴胡對照藥材0.5 g，加適量水煮沸1 h，濾過，濾液濃縮至15 mL，水液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25 mL，其余步驟同供試品溶液的制備方法，即得對照藥材溶液。按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部中有關薄層色譜法的步驟[6]進行試驗,吸取上述兩種溶液各3～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干。噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60℃加熱至斑點顯色清晰,日光下檢視。在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾，見圖2。

圖2 柴胡薄層色譜圖

注：1為崗梅清瘟敗毒合劑180729供試品；2為崗梅清瘟敗毒合劑180730供試品；3為柴胡對照藥材；4為缺柴胡陰性對照；5為崗梅清瘟敗毒合劑180731供試品。

2.2.3 粉葛的鑒別：取2.2.1 中用于鑒別黃芩的備用水溶液，用氨試液調至中性,用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25 mL；合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取葛根素對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部中有關薄層色譜法的步驟[6]進行試驗,吸取上述兩種溶液各3～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干。置氨蒸氣中熏后，紫外燈365 nm下檢視。在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾，見圖3。

圖3 葛根薄層色譜圖

注：1為崗梅清瘟敗毒合劑180729供試品；2為崗梅清瘟敗毒合劑180730供試品；3為葛根素對照品；4為缺粉葛陰性對照；5為崗梅清瘟敗毒合劑180731供試品。

3 討 論

手足口病作為危害人類健康的重要傳染疾病，目前尚無特效治療藥物。中醫藥或可通過綜合治療效應，對手足口病的防治發揮積極作用。祖國中醫認為手足口病是由于外感時邪疫毒，內傷濕熱蘊結，衛表被遏，肺氣失宣，心脾積熱所致；主要病位在肺、脾、心三臟，嚴重可累及心包經和肝經，同時存在衛氣營血轉變[7]。中醫醫治本病以清熱利濕透疹為主要治療原則，辛涼解表、清熱、除濕、解毒、理脾助運兼以清化，采用辨證施治、分期論治等方法，可取得比較良好的療效[8-9]。崗梅清瘟敗毒合劑所包含的麻黃、柴胡具有發汗解表、宣肺平喘等功效[10-11]，黃芩、梅葉冬青、山芝麻等能夠清熱瀉火、解毒涼血[12-13]，葛根、竹葉等能夠疏風散熱、生津開郁[14]，與壯醫理論治療疾病的基本原則相一致。利用正交實驗設計，我們篩選出了崗梅清瘟敗毒合劑的最佳制備工藝，具體條件為藥材浸泡0 h，提取溶劑量為加水量的8/6/6倍，提取次數為2次，提取時間為1.5 h。這既節省了實驗時間及實驗試劑，又具有較高的提取效率，工藝穩定，適合大工業生產。

對于中藥復方制劑的鑒別，應根據其特點，尋找簡便、快速并具有較強專屬性的方法，才能起到有效控制質量的目的[15]。為了更好地控制崗梅清瘟敗毒合劑藥品的質量標準，本研究制定了黃芩、粉葛、柴胡的薄層色譜鑒別方法。對于柴胡的鑒別，在提取供試品時，我們發現先用乙酸乙酯振搖提取并棄去乙酸乙酯液，再用水飽和的正丁醇振搖提取，色譜帶清晰；在選擇展開劑試驗中，經比較三氯甲烷-甲醇-水(6.5 ∶3 ∶0.5)、三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)的層析效果，我們發現以前者作為展開劑時，展開劑極性太大，斑點Rf值過高，以后者為展開劑時，斑點Rf值最佳，分離效果最佳，故最終選擇三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)作為展開劑。在鑒別粉葛時，我們發現用鹽酸酸化樣品后，用乙酸乙酯振搖提取后的水溶液，再用水飽和的正丁醇振搖提取，樣品斑點無雜質干擾。鑒別柴胡時，我們采用三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)作為展開劑，斑點Rf值合適。黃芩、粉葛、柴胡的薄層色譜鑒別結果顯示陰性無干擾，提示合劑的薄層色譜鑒別方法可行，專屬性強，重復性良好，這有利于更好地控制崗梅清瘟敗毒合劑的制劑質量。