磷礦區(qū)高效解磷菌的分離鑒定及其堿性磷酸酶的克隆表達(dá)

寧 清，劉 迪，靳 翔，弓亞杰，薛智權(quán)，呂建華

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

山西省是礦產(chǎn)資源大省，為國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展作出了不可估量的貢獻(xiàn)，但礦產(chǎn)資源開發(fā)的同時(shí)也使農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境遭受到了非常嚴(yán)重的破壞。山西省還是全國中藥材的主采區(qū)之一，是中藥資源大省。而在采礦復(fù)墾區(qū)種植中藥材既能改善復(fù)墾區(qū)土壤生態(tài)系統(tǒng)，也可為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展帶來推動(dòng)力。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要物質(zhì)保障離不開磷，它是植物生長發(fā)育中最主要的營養(yǎng)元素之一[1]。然而，礦區(qū)復(fù)墾土壤因?yàn)閲?yán)重缺乏可溶性磷，造成養(yǎng)分含量降低、微生物數(shù)量減少、溶磷活力低下、土壤貧瘠[2-3]，導(dǎo)致作物生長緩慢，產(chǎn)量低，質(zhì)量差。為了滿足作物對(duì)土壤磷元素的需求，提高作物產(chǎn)量，農(nóng)民大量施用化學(xué)磷肥，但施入磷肥的成本高、有效轉(zhuǎn)化效率過低、浪費(fèi)嚴(yán)重；同時(shí)化學(xué)肥料的過度施用會(huì)對(duì)土壤和水體環(huán)境造成嚴(yán)重的污染[4]，而且肥料中70% 以上的水溶性磷會(huì)與土壤中的Fe3+、Al3+、Ca2+等結(jié)合，生成非常難溶的磷酸鹽沉淀。生物固定化和其他反應(yīng)會(huì)很快耗盡可用的磷酸供應(yīng)，留下極少部分供給植物[5-6]。因此，釋放土壤中固定化的磷可以增加土壤中磷元素的生物利用度。

土壤微生物在磷循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用，其中，一些細(xì)菌可以通過溶解不溶性磷酸鹽來提高植物的有效磷庫，其被稱之為解磷菌。目前報(bào)道，較多的解磷菌主要包括芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、無色桿菌屬（Achromobacter）、固氮菌（Azotobacter）、農(nóng)桿菌（Agrobacterium）、微球菌（Micrococcus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、根瘤菌（Rhizobium sp.）等[7-8]。這些溶磷微生物能夠通過分泌有機(jī)酸、無機(jī)酸、嗜鐵素、H2S、腐殖質(zhì)、磷酸酶、胞外多糖等物質(zhì)或NH4+同化作用將土壤中無效磷轉(zhuǎn)化為植物可以充分利用的有效磷，提升磷肥利用率，改善土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)作物生長[5，9]。目前，已有將解磷菌應(yīng)用于玉米、青菜、小麥、大麥、油菜等作物種植，并取得了較好的效果[3，10-13]。另外，王樣庭等[14]從中藥材牛蒡的根際土壤中也分離得到了活性較高的溶磷菌株。因此，解磷菌在促進(jìn)中藥材生長等方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本研究從山西祁縣磷肥廠磷礦石堆積區(qū)和排污口收集土壤樣品，利用選擇培養(yǎng)基從樣品中篩選具有解磷活性的菌株，并通過分離、純化、復(fù)篩，得到1 株具有高解磷活性的菌株SXAU- S1；結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征研究和16S rDNA 序列的方法對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，另外還克隆并表達(dá)了該菌株的堿性磷酸酶基因，旨在了解該菌株的解磷能力，為開發(fā)新的廉價(jià)、高效且環(huán)境友好的微生物菌肥提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)加快復(fù)墾區(qū)土壤生態(tài)修復(fù)、提高復(fù)墾區(qū)種植作物的質(zhì)量和產(chǎn)量具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試土壤 土壤樣品采集自山西省祁縣磷肥廠的磷礦石堆積區(qū)和排污口。采集方法為3 點(diǎn)采樣法，去除表層土，用滅菌后的鏟子挖取深度5～20 cm 的土壤，去除石塊后，將3 個(gè)不同點(diǎn)的土壤樣品混合成一份，裝入50 mL 無菌離心管中，標(biāo)記好采樣信息，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 篩選培養(yǎng)基NBRIP[15]葡萄糖10 g，磷酸鈣5 g，六水氯化鎂5 g，七水硫酸鎂0.25 g，氯化鉀0.2 g，硫酸銨0.1 g，瓊脂15 g，去離子水1.0 L，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.2 富集培養(yǎng)基LB 液體培養(yǎng)基 酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，去離子水1.0 L，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.3 優(yōu)化培養(yǎng)基 在1.1.2.1 的NBRIP 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別將葡萄糖（10 g）替換為甘油10.23 g、蔗糖9.5 g、乳糖9.5 g，或是分別將硫酸銨（0.1 g）替換為尿素0.04 g、氯化銨0.08 g、硝酸鉀0.15 g。

1.1.3 其他試劑 試驗(yàn)所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 解磷菌的分離與初篩 將不同的土壤樣品各稱取10 g 分裝到三角瓶中，加入50 mL 雙蒸水，富集一晚上；第2 天將其靜置20 min，用移液槍吸取上層100 μL 到固體篩選培養(yǎng)基平板上，涂布后在28 ℃進(jìn)行培養(yǎng)；5 d 后觀察，挑取具有較大溶磷透明圈的菌株，接種到篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，重復(fù)試驗(yàn)直到出現(xiàn)單克隆菌株透明圈為止；接種到富集培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)（220 r/min，28 ℃），24 h后，菌株生長濃度達(dá)到要求，取200 μL 菌液和200 μL 甘油保存并標(biāo)記。

1.2.2 解磷菌鑒定

1.2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察 吸取少許新鮮菌加入生理鹽水稀釋，在酒精燈上方搖動(dòng)干燥，用結(jié)晶紫初染1～2 min，水洗；晾干后再取碘液復(fù)染1 min，水洗，95%乙醇脫色20 s，水洗，番紅復(fù)染2 min，水洗晾干，在高倍顯微鏡下觀察。

1.2.2.2 菌株的分類學(xué)鑒定 試驗(yàn)以所得菌株的總DNA 為模板進(jìn)行16S rDNA 擴(kuò)增，通過對(duì)其序列比對(duì)以確定菌株的種屬。總DNA 提取采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（康為世紀(jì)公司，北京）提取，操作步驟按照說明書進(jìn)行。所用引物為細(xì)菌16S 序列擴(kuò)增通用引物27F（5′- AGAGTTTGATCATGGCT CAG- 3′）和1492R（5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：5 μL10 × buffer，2 μL dNTP，2 μL 27F，2 μL 1492R，2 μL 基因組DNA，1 μL Taq DNA 聚合酶，36 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s ，共35 個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃延伸5 min。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，然后將PCR 產(chǎn)物送到北京華大基因有限公司進(jìn)行直接測序。采用Blast 軟件對(duì)所得序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫里進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)同源性確定其種屬。

1.2.3 解磷菌生長條件優(yōu)化

1.2.3.1 碳源和氮源的影響 分別以蔗糖、乳糖、甘油、葡萄糖為篩選培養(yǎng)基中唯一碳源，其培養(yǎng)條件不變，按1%的接種量接種菌株S1，于28 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，以不接菌為對(duì)照組，每個(gè)處理重復(fù)3 次，取上清液用酶標(biāo)板測定600 nm 處的吸光度。同理以尿素、氯化銨、硝酸鉀為唯一氮源替換等量氮元素含量的硫酸銨，從而研究不同碳氮源對(duì)菌株生長濃度的影響。發(fā)酵液解磷活性測定采用鉬銻抗法[16]。

1.2.3.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化 根據(jù)1.2.3.1 的試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳的碳源和氮源，采用L16（44）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化S1 的生長條件，以不接菌為對(duì)照，重復(fù)3 次，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1 所示。

表1 培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)各因素和水平設(shè)置

1.2.4 菌株堿性磷酸酶基因的克隆和表達(dá)

1.2.4.1 菌株堿性磷酸酶基因的克隆 根據(jù)1.2.2的結(jié)果，在GenBank 數(shù)據(jù)庫中搜索成團(tuán)泛生菌Pantoea agglomerans 的堿性磷酸酶基因序列（JYGW 01000006.1：39510- 40523），以此為參照設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物C6- AKP- F（5- CCGGAATTCGATGTTTTATTCCCTCCG- 3）和C6- AKP- R（5- CCGCTCGAGCACTT TGGGATTGGTCAG- 3），其中，上游引物劃線部分為EcoR I 酶切位點(diǎn)，下游引物劃線部分為Xho I 酶切位點(diǎn)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，并采用凝膠回收試劑盒（TransGen，北京）對(duì)目的條帶進(jìn)行回收。回收產(chǎn)物與pBackZero T Vector（Takara，大連） 連接后轉(zhuǎn)化進(jìn)Escherichia coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，采用基因特異性引物PCR 擴(kuò)增確定插入片段后，將陽性克隆送去測序。

1.2.4.2 菌株堿性磷酸酶基因的表達(dá) 將經(jīng)測序驗(yàn)證序列正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I＋Xho I 雙酶切，與相同雙酶切后的pET22b 表達(dá)質(zhì)粒連接，構(gòu)成表達(dá)重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入到Escherichia coli BL21 表達(dá)宿主菌中。挑取單克隆接種到含有氨芐的液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃200 r/min 培養(yǎng)，待菌液的OD600值到0.8 左右時(shí)，加入終濃度1 mmol/L 的IPTG，16 ℃200 r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，離心收集菌體，懸浮于磷酸緩沖液中，超聲破碎后，12 000 r/min 離心10 min，留取上清。采用考馬斯亮藍(lán)G250 染色法測定蛋白濃度，采用SDS- PAGE 和考馬斯亮藍(lán)R250 染色法觀察裂解液中蛋白的表達(dá)情況。收集2 mL 發(fā)酵液的菌體，用500 μL PBS 懸浮，超聲裂解后離心，收集上清，取50 μL 裂解液加入到NBRIP 液體中，28 ℃反應(yīng)30 min 后，測定溶液中有效磷的含量，即為重組菌裂解液堿性磷酸酶的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效解磷菌的分離與純化

本試驗(yàn)采用以磷酸鈣為唯一磷源的NBRIP 培養(yǎng)平板對(duì)菌株進(jìn)行初步篩選，具有解磷活性的菌株能夠分解培養(yǎng)基中的磷酸鈣，形成透明圈，結(jié)果如圖1 所示，通過初篩分離出單克隆11 株解磷菌，編號(hào)為SXAU- S1～SXAU- S11；選擇透明圈大、生長狀況良好的菌株SXAU- S1 進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 解磷菌鑒定

挑取SXAU- S1 單克隆進(jìn)一步純化后，采用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，然后吸取菌液進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察結(jié)果如圖2 所示，可見菌體為革蘭氏陰性球菌，菌體直徑約0.5～1.0 μm，液體培養(yǎng)狀態(tài)下呈彌散分布。

提取菌株基因組DNA，電泳結(jié)果如圖3- A 所示，結(jié)果顯示，總DNA 含量較少且有部分降解，可能是由菌體裂解時(shí)間過長所致。以基因組DNA 為模板，擴(kuò)增16S rDNA 序列，電泳結(jié)果如圖3- B 所示，結(jié)果顯示，在1 500 bp 附近有單一的條帶，符合預(yù)期設(shè)計(jì)大小。

對(duì)菌株SXAU- S1 的16S rDNA 擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，將得到的序列提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫中，序列ID 為MK875137。在GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，并與相近的序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4 所示，該序列與Pantoea agglomerans strain 48b/90 的16S rRNA 序列（Sequence ID: FJ756354.1）在分類學(xué)上位置最接近。結(jié)合形態(tài)特征，依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，確定該菌株為Pantoea agglomerans，命名為Pantoea agglomerans strain SXAU- S1。

2.3 不同培養(yǎng)基成分對(duì)菌株SXAU-S1 生長的影響

2.3.1 不同碳源對(duì)菌株生長狀況的影響 菌株SXAU- S1 在不同碳源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，測得的菌體濃度值如圖5 所示。由圖5 可知，菌株SXAU- S1 在不同碳源培養(yǎng)基中生長狀態(tài)存在差異，OD600的測定值大小依次為甘油＞葡萄糖＞蔗糖＞乳糖。以甘油為唯一碳源時(shí)，過夜培養(yǎng)的SXAU- S1發(fā)酵液達(dá)到0.685，顯著高于乳糖（P＜0.01）；也高于以蔗糖和葡萄糖作碳源的培養(yǎng)基，但沒達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。可能是由于該菌株在生長過程中，優(yōu)先利用低碳化合物，而乳糖代謝途徑比較復(fù)雜，菌株SXAU- S1 不能很好地利用乳糖。

2.3.2 不同氮源對(duì)菌株生長狀況的影響 由圖5可知，菌株SXAU- S1 在氯化銨、硝酸鉀和硫酸銨培養(yǎng)基中生長速度差不多，但都比在尿素液體培養(yǎng)基中生長狀況要好。可能是由于菌株SXAU- S1 在生長過程中利用無機(jī)氮的效率要大于有機(jī)氮。

2.3.3 其他培養(yǎng)條件的優(yōu)化 根據(jù)碳源和氮源的試驗(yàn)結(jié)果，確定培養(yǎng)基中碳源選用甘油，氮源選用氯化銨，設(shè)計(jì)4 因素4 水平正交試驗(yàn)，進(jìn)一步考察培養(yǎng)基pH 值和溫度對(duì)菌體生長的影響，結(jié)果列于表2，根據(jù)K 值和R 值可知，4 個(gè)因素對(duì)菌株SXAU- S1 生長的影響大小順序?yàn)槁然@＞PH＞T＞甘油。正交試驗(yàn)初步得到，在接種量為1%時(shí)，最優(yōu)條件為氯化銨0.4 g/L、pH 值為9、T 為33 ℃、甘油為10 g/L。

表2 菌株SXAU-S1 培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇最優(yōu)培養(yǎng)條件，培養(yǎng)72 h 后，測定發(fā)酵液中有效磷的含量和pH 值，結(jié)果顯示，發(fā)酵液中有效磷含量最高達(dá)到了287.48 mg/L，而發(fā)酵液的pH 值降低到3.67。

2.4 菌株SXAU-S1 堿性磷酸酶基因的克隆與表達(dá)

2.4.1 SXAU- S1 菌株堿性磷酸酶基因的克隆 以SXAU- S1 基因組DNA 為模板，以堿性磷酸酶特異性引物C6- AKP- F/R 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果如圖6- A 所示，結(jié)果顯示，在1 000 bp 附近有單一條帶。將該條帶切膠回收后，與T 載體相連接構(gòu)成重組克隆質(zhì)粒T- akp，轉(zhuǎn)化進(jìn)Escherichia coli DH5α，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。對(duì)得到的序列進(jìn)行分析，所得序列長度為1 014 bp，是一個(gè)包含起始密碼和終止密碼的完整開放閱讀框。經(jīng)Blast比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列與Pantoea agglomerans strain L15 的aminopeptidase 基因（Accession No.：CP034148）具有99%的相似度，二者的開放閱讀框長度一致，但是編碼區(qū)有5 個(gè)堿基不同，分別為52（T- G）、110 （T- C）、388 （C- T）、487 （C- T）、1 000（T- C）。進(jìn)一步將二者的編碼序列翻譯成蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，完全一致，揭示堿性磷酸酶在該菌不同株系中比較保守。

2.4.2 菌株SXAU- S1 堿性磷酸酶基因的表達(dá) 陽性表達(dá)重組菌不同裂解液的SDS- PAGE 電泳結(jié)果如圖6- B 所示，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的菌體裂解液中，在38 ku 附近有一條明顯的蛋白條帶，其大小符合以該基因翻譯后多肽鏈計(jì)算的結(jié)果。

2.4.3 重組菌裂解液堿性磷酸酶活性測定 以NBRIP 液體為底物，加入誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體裂解液，28 ℃反應(yīng)30 min 后，檢測溶液中的有效磷含量，結(jié)果顯示，含量達(dá)到了941.97 mg/L。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算，重組菌裂解液溶磷活性為原始菌株最優(yōu)培養(yǎng)條件下的32.77 倍。

3 結(jié)論與討論

目前，對(duì)解磷菌的研究以芽孢桿菌、假單胞菌、伯克氏菌等為主[17-20]，且得到的解磷菌活性普遍較低，有效溶磷能力最高的為215.43 mg/L。本試驗(yàn)從磷礦堆積區(qū)篩選得到的菌株為成團(tuán)泛生菌，作為溶磷菌在以前還鮮有報(bào)道。在本試驗(yàn)條件下，該菌的最大溶磷量達(dá)到了287.48 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前面文獻(xiàn)的試驗(yàn)結(jié)果。在培養(yǎng)基條件方面，不同碳源會(huì)改變產(chǎn)生的有機(jī)酸影響解磷菌的生長濃度和解磷效果[5]，衛(wèi)星等[21]篩選出的巨大芽孢桿菌以葡萄糖為碳源時(shí)解磷量高于以蔗糖、麥芽糖和淀粉為碳源，且研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中pH 的變化與菌株對(duì)碳源的利用次序一致，二者均表明菌株的產(chǎn)酸能力與碳源的利用順序一致。本研究得到的成團(tuán)泛生菌株，以甘油為唯一碳源時(shí)解磷量高于以葡萄糖為唯一碳源，培養(yǎng)基中pH 的變化與菌株對(duì)碳源的利用次序也一致。在氮源方面，成團(tuán)泛生菌優(yōu)先利用無機(jī)氮，與常慧萍等[19]從小麥根際分離得到的假單胞菌對(duì)氮源的選擇顯著不同，表明菌株的生理特性與其來源相適應(yīng)。該特點(diǎn)也使本試驗(yàn)中的成團(tuán)泛生菌很適于應(yīng)用到采礦區(qū)等地的復(fù)墾上，對(duì)于解決礦區(qū)難溶性磷轉(zhuǎn)化問題、改善土壤環(huán)境、為礦區(qū)作物和中藥材的生長提供良好的保障具有重大意義。該菌株堿性磷酸酶蛋白的體外表達(dá)也為該酶的工業(yè)應(yīng)用提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究從磷礦區(qū)土壤篩選得到1 株具有高溶磷活性的解磷菌，經(jīng)16S rDNA 鑒定其為成團(tuán)泛生菌。對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳碳源為甘油，最佳氮源為氯化銨。另外，還克隆了該菌中的堿性磷酸酶，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。