采用熒光顯微技術對棗瘋病病原進行鑒定

申仲妹，陳紅玉，楊俊強，馬光躍，薛新平，郭建民，孫錫峰，連永宏

（1.山西省農業科學院園藝研究所，山西太原030031；2.永和縣林業局，山西永和041400）

棗瘋病也稱作“棗癌癥”，它是一種由植原體所引起的維管束系統侵染性病害[1-8]。在棗樹生產上典型癥狀表現為花變葉和叢枝，患病較輕的棗樹會出現花臉果現象，嚴重時可導致樹體死亡。經調查發現，目前山西省沿黃棗區都有棗瘋病發病現象，有的地方棗瘋病出現成片發病、全園發病、全園絕收的情況。目前該病原還未能進行離體培養。

本試驗利用越冬期枝條水培方法，采用熒光染料（DAPI）染色技術，對條棗感病枝條和健康枝條的幼莖進行了對比診斷研究，旨在為快速、便捷、定性定量判斷棗瘋病病原提供技術支撐[9-13]。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

分別在2018 年1 月18 日、3 月9 日采集山西省臨汾市永和縣打石腰鄉河澮里村棗園條棗的病枝和健枝用于水培試驗。

1.2 試劑及儀器

5%戊二醛溶液（50%戊二醛用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液稀釋而成）、0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH值7.0）（取磷酸二氫鉀0.68 g，加0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液29.1 mL，用水稀釋至100 mL 即得）、1.0 μg/mL DAPI（100 μg/mL DAPI 用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液稀釋而成）、1%霍蘭格營養液。

落射式olympusDP72 熒光顯微鏡、BLC- 300 人工氣候箱。

1.3 試驗方法

1.3.1 越冬枝條的水培試驗 水培液體分為蒸餾水、1%霍蘭格營養液2 種。在200 mL 燒杯中放置5～8 枝30 cm 長條棗品種的枝條，分別加入100 mL水培液體。每隔2 d 換1 次水培液體，將原先的枝段用清水沖洗干凈，將枝條末端剪成馬蹄截面，再次放入新液體中。將燒杯放入人工氣候箱中培養，使其萌發抽枝達3～5 cm，即可測定水培枝條的總枝條數、總芽數、萌芽數、成枝數。每個處理3 次重復。人工氣候箱內環境條件為：溫度25 ℃，濕度70%，光暗間隔時間分別為光照16 h，黑暗8 h。

1.3.2 DAPI 熒光顯微檢測觀察[14]

1.3.2.1 試材固定 將水培后萌發的棗吊離體后固定在5%戊二醛溶液中，并保存在4 ℃冰箱中至少2 h 后待用。

1.3.2.2 切片 將試材從5%戊二醛溶液中取出并用清水沖洗干凈，用嶄新刀片將棗吊的幼嫩組織切成厚薄均勻的小圓片。

1.3.2.3 DAPI 染色 將40～50 片切片浸泡在為1.0 μg/mL DAPI 染色劑中染色15～20 min。

1.3.2.4 熒光顯微觀察 將染好色的切片15～20 片放置在載玻片上，加上蓋玻片后用吸紙將四周液體吸干，將其放置在落射式olympus DP72 熒光顯微鏡下鏡檢，WU（紫光）激發，透射光365 nm，阻濾光420 nm，觀測并拍照。

1.4 數據分析

數據經過Excel 2003 初步處理后，采用方差分析軟件進行新復極差多重比較。

2 結果與分析

2.1 條棗品種越冬期枝條水培情況調查

從表1 可以看出，條棗的病枝與健枝通過水培后病枝萌芽率為32.7%，健枝的萌芽率為64.4%，相應的成枝率病枝為24.5%，健枝為47.5%；但從枝條芽數看，病枝芽數為98 個，健枝芽數為59 個，它們之間存在極顯著差異，但是萌芽數與成枝數上二者間并不存在顯著差異。究其原因，病枝患病后前期用于叢枝生長消耗大量枝條營養，從而導致越冬枝條形成的新芽不飽滿，影響第2 年的正常生長。為了確保棗瘋病病原的正常觀測，建議試材用量為：30 cm 長的枝條，病枝數量至少是健枝數量的1 倍以上。

表1 條棗品種越冬期枝條水培情況調查

2.2 條棗品種越冬期枝條不同液體水培情況調查

表2 條棗品種越冬期枝條不同液體水培情況調查

從表2 可以看出，由于培養枝條的液體不同萌芽率也不同。病枝水培在蒸餾水中的萌芽數與水培在1%霍蘭格營養液中的萌芽數之間不存在顯著性差異，萌芽數稍低于水培在1%霍蘭格營養液的病枝，它們的萌芽率分別為21.7%，39.7%；但是健枝水培在蒸餾水中的萌芽數與水培在1%霍蘭格營養液的健枝存在極顯著差異，健枝的萌芽率分別為64.4%，92.9%。試驗也說明為了獲取更多試驗材料，通過補充外源營養物質可彌補枝條本身營養欠缺的遺憾。

2.3 DAPI 染色條棗嫩莖中植原體觀察

經DAPI 染色后，在落射式olympusDP72 熒光顯微鏡下觀察到，取自條棗病枝上的嫩莖橫切片中的韌皮部有云片狀或團狀不規則的熒光帶呈現，且不均勻分布（圖1- A），而取自條棗健枝上的嫩莖橫切片中的韌皮部熒光大小一致，分布均勻（圖1- B）。

3 結論與討論

王秀伶等[14]在鑒定棗瘋病植原體的過程中強調，DAPI 是一種DNA 專化的熒光染料，當它與DNA 結合后會產生很強的熒光。植原體DNA 與DAPI 結合后產生的特異性熒光亮度大，且亮點有大有小，很不均勻，熒光亮點時常呈現團狀或云片狀。李成亮[15]研究認為，DAPI 本身的熒光極其微弱，但與DNA 結合后復合物的熒光度驟然上升，是檢測DNA 的高效熒光染料。本試驗結果與此相吻合。

條棗的病枝與健枝通過水培后從枝條芽數看，它們之間存在極顯著性差異，但是從萌芽數與成枝數上二者并不存在顯著性差異。究其原因，病枝患病后前期用于叢枝生長消耗大量枝條營養，從而導致越冬枝條形成的新芽不飽滿，影響第2 年的正常生長。

由于培養枝條的液體不同，萌芽率也不同：病枝水培在蒸餾水中的萌芽數與水培在1%霍蘭格營養液中的萌芽數之間不存在顯著性差異，萌芽數稍低于水培在1%霍蘭格營養液的病枝，它們的萌芽率分別為21.7%，39.7%；但是健枝水培在蒸餾水中的萌芽數與水培在1%霍蘭格營養液的健枝相比它們存在極顯著差異，健枝的萌芽率分別為64.4%，92.9%。試驗也說明為了獲取更多試驗材料，通過補充外源營養物質可彌補枝條本身營養欠缺的遺憾。

本試驗通過采集越冬期條棗品種棗瘋病枝條對其進行水培，以正常枝條水培為對照，采用熒光顯微技術（DAPI）對水培枝條的幼莖進行對比診斷研究，結果表明，越冬期枝條水培采集最佳時間為1 月；水培溶液為1%霍蘭格營養液；試材需固定在5%戊二醛溶液放置4 ℃冰箱2 h 以上、1.0 μg/mL DAPI 染色劑中染色20 min，便可快速、便捷、定量定性判斷棗瘋病病原。DAPI 染色技術作為檢測植原體侵染的一種手段，可在藥物防治棗瘋病的篩選研究工作中加以應用。