凍結與解凍處理對豬肉肌原纖維蛋白凝膠特性及分子間作用力的影響

刁小琴，關文婷，關海寧，張 瑛，云 波，黎 亞

（綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化152061）

冷凍是迄今為止一種應用廣泛、價格低廉、效果較好的保藏肉的方法；解凍是凍結肉中的冰晶融化，并被肉重新吸收恢復到凍結前新鮮狀態的過程[1]。通常肉經凍結、解凍處理后會出現色澤和質地變差、汁液流失、保水性降低等問題[2]，因此，凍結與解凍方式的選擇對肉的品質起著非常重要的作用。肌原纖維蛋白是豬肌肉的重要組成成分之一，具有持水性、乳化性以及凝膠性等多重功能特性。蛋白質的凝膠特性在肉制品加工中決定著成品的質構和感官。SAELEAW 等[3]研究發現，隨著凍結時間的延長，魚類肌原纖維蛋白形成的凝膠強度變小。任麗娜[4]研究冷凍對白鰱魚肌原纖維蛋白凝膠形成的影響，結果發現，冷凍會減弱凝膠的形成能力。劉富康[5]研究發現，微波解凍的魚糜，其凝膠持水力和凝膠形成能力較差。

本試驗將豬肉采用- 18，- 50 ℃凍結，然后分別以微波、空氣及4 ℃解凍方式對其進行解凍，研究不同凍結與解凍方式對豬肉肌原纖維蛋白凝膠特性及凝膠形成過程中蛋白質分子間作用力的影響，旨在為凝膠的形成機制奠定理論基礎，同時為獲得維持豬肉凝膠較好品質以及為實際肉品的凍結和解凍提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料 供試材料為豬背最長肌，購自綏化市大潤發超市。購買后快速運回實驗室，剔除豬肉表面脂肪和結締組織，切分為100 g 左右的肉塊，進行冷凍處理。

1.1.2 試劑 牛血清蛋白（北京索萊寶科技有限公司）；乙二醇雙（2- 氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）（北京華邁科生物技術有限責任公司）；哌嗪- 1，4- 二乙磺酸（PIPE，上海麥克林生化科技有限公司）；β-巰基乙醇（分析純，上海建鑫化工試劑廠）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銅、氯化鎂、氯化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設備

TH- 120- 150- WA 超低溫冰箱（北京天地精儀科技有限公司）；GL- 16G- Ⅱ高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；DS- 1 高速組織搗碎機（上海凈信實業發展有限公司）；ZE- 6000 色差計（日本色電工業株式會社）；TA- XT plus 型質構分析儀（英國Stable Micro System 公司）；752 紫外- 可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的凍結 切分好的肉塊隨機分成2 組，每組3 塊，分別置于- 18，- 50 ℃條件下凍結，凍藏3 d 后進行解凍處理；同時以新鮮肉樣不進行處理為對照組（CK）。

1.3.2 樣品的解凍 2 個凍結組分別采用微波解凍、空氣解凍（室溫20 ℃）和4 ℃條件下解凍。

1.3.2.1 空氣解凍 將凍結肉樣放入潔凈的塑料托盤中，以空氣為介質進行自然解凍，肉塊中心溫度達到4 ℃即可。

1.3.2.2 微波解凍 將凍結肉樣放入潔凈的塑料托盤中，置于微波爐中，啟動質量解凍按鈕，解凍到肉塊中心溫度達到4 ℃即可。

1.3.2.3 4 ℃解凍 將凍結肉樣放入潔凈的塑料托盤中，置于4 ℃冰箱進行解凍，肉塊中心溫度達到4 ℃即可。

1.3.3 肌原纖維蛋白的提取 參照XIA 等[6]的方法從不同處理組中提取肌原纖維蛋白，以牛血清蛋白為標準品，采用雙縮脲法進行測定[7]。

1.3.4 凝膠的制備 將不同處理得到的肌原纖維蛋白用50 mmol/L PIPES（含0.6 mol/L NaCl，pH 值6.0）配成40 mg/mL 的溶液，將溶解的蛋白溶液分裝于凝膠瓶中于4 ℃條件下平衡過夜，次日取出室溫平衡30 min，放入72 ℃水浴加熱10 min 后立即取出冰浴冷卻，用于凝膠強度、白度、持水性以及凝膠在形成過程中蛋白質分子間作用力的測定。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 凝膠強度的測定 參考秦傳軍等[8]的方法，稍作改動。采用質構分析儀進行測定，采用P/0.5 柱形探頭（直徑12 mm），將凝膠置于探頭正下方，前進速度為1 mm/s，穿刺距離為10.0 mm，用穿透力來表示凝膠強度。

1.4.2 凝膠白度的測定 參考于建行[9]的方法，稍作改動。將樣品在室溫平衡一段時間，用色差計測定，要求凝膠填滿整個樣品池，樣品池底部置于載物臺上，每個樣品順著一個方向旋轉3 次，分別測定，最后取其平均值。

式中，L*值代表亮度，a*值代表紅度，b*值代表黃度。

1.4.3 凝膠持水性的測定 參考唐曉婷等[10]的方法，稍作改動。分別稱取不同處理的肌原纖維蛋白凝膠樣品各5g，放入離心管中，4℃條件下6000r/min離心15 min，倒出上層液體，用濾紙吸干凝膠表面殘余的水分。

式中，M1為離心前凝膠的質量（g）；M2為離心后凝膠的質量（g）。

1.4.4 凝膠在形成過程中蛋白質分子作用力的測定 將1 g 凝膠分別加入3 種不同的蛋白變性劑中，混合后于13 500 r/min 均質20 s；為了達到最大的溶解度，將其放在80 ℃的水浴鍋中加熱1 h，4 000×g 離心15 min，吸取上清液，通過雙縮脲法測定蛋白含量。其中，蛋白溶解度即為上清液中溶解出的蛋白含量占凝膠中總蛋白的百分比。蛋白變性劑分別為含8 mol/L 尿素的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 值7.0，用以分析氫鍵的作用）、含0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS） 的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 值7.0，用以分析疏水相互作用） 和含0.25%β- ME 的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 值7.0，用以分析二硫鍵的作用）。

1.5 數據統計分析

每個試驗結果均用平均數±標準誤表示。采用Excel 2010 作圖，差異顯著性分析采用Statistix 8.1軟件進行。

2 結果與分析

2.1 不同凍結與解凍方式對凝膠強度的影響

凝膠強度是凝膠的一個重要品質特性，好的凝膠特性不僅可以提高肉制品的品質，還可以提高產品的得率。由圖1 可知，冷凍和解凍處理使肌原纖維蛋白的凝膠強度呈下降趨勢。除了采用- 50 ℃凍結4 ℃解凍的處理組的凝膠強度與未經處理的肌原纖維蛋白（CK）差異不顯著外（P＞0.05），其余處理均較對照組顯著下降（P＜0.05），這可能是由于凍結及解凍處理使肌原纖維蛋白發生了變性、降解等[11]。

從圖1 還可以看出，不論采用哪種解凍方式，- 50 ℃凍結的處理組其凝膠強度顯著高于- 18 ℃凍結的處理組（P＜0.05），同時，不論采用哪種凍結溫度，微波解凍處理組的凝膠強度均表現為最小。SAELEAW 等[3]也報道，凍結會減弱魚類肌原纖維蛋白的凝膠能力，進而使其強度減小。郭恒等[1]研究發現，魚肉的硬度隨著解凍溫度的升高而減小。余力等[12]研究不同的解凍方式對伊拉兔肉品質特性的影響，結果發現，低溫解凍后的兔肉硬度下降最小，而微波解凍的硬度下降最大。

2.2 不同凍結與解凍方式對凝膠白度的影響

凝膠白度決定凝膠的外觀品質。從圖2 可以看出，不同的凍結溫度與解凍方式均造成了凝膠白度的下降，這可能是由于凍結解凍方式造成了蛋白的變性。HWANG 等[13]也報道了凝膠白度的變化與蛋白質的變性程度有關。

圖2 結果還顯示，不論是哪種凍結方式，微波解凍與空氣解凍均較對照組顯著下降（P＜0.05），說明這2 種解凍方式對蛋白的變性影響程度比較大，而4 ℃解凍與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），可能是因為低溫緩慢解凍溫度分布均勻，不易產生局部過熱現象，對蛋白的傷害比較小。夏秀芳等[14]研究報道，凍藏過程中凝膠白度的降低可能是由于色素蛋白與肌肉蛋白的交聯，使其在蛋白提取過程中，色素蛋白去除不完全。本研究在采用相同的解凍方式下，- 18，- 50 ℃凍結的樣品，凝膠白度差異均不顯著（P＞0.05），這可能是由于凍結時間短，色素蛋白與肌肉蛋白的交聯還未發生，或者二者交聯程度不大，因此，在蛋白提取過程中，容易被除去。

2.3 不同凍結與解凍方式對凝膠持水性的影響

凝膠的持水性直接影響著凝膠制品的嫩度、多汁性等品質。在凝膠的形成過程中，蛋白質受熱變性、聚集、交聯成三維網狀結構，良好的凝膠能夠通過毛細管作用而固定凝膠網絡里的水。

從圖3 可以看出，肌肉經凍結再解凍處理后，其肌原纖維蛋白凝膠的持水性均表現出下降的趨勢，但- 50 ℃凍結、4 ℃解凍的處理組與對照差異不顯著（P＞0.05）。這可能是由于- 50 ℃凍結與- 18 ℃凍結相比，能在更短的時間內迅速通過- 5～0 ℃這一最大冰晶生成帶，有效減小了蛋白質的變性和細胞的損傷，再加上采用4 ℃解凍的方式，升溫慢且平穩，解凍產生的能量較弱，解凍的肌肉溫度分布均勻，不易產生局部過熱現象，較好地維持了凝膠的持水性。而不論是哪種凍結方式，采用微波解凍均造成凝膠持水性顯著下降（P＜0.05），這可能是由于微波解凍能量比較高，在肌肉傳遞過程中發生局部聚集，部分蛋白變性，進而造成蛋白形成的凝膠網狀結構致密性比較差，持水性較弱。余文暉等[15]研究不同解凍方式對金槍魚持水性的影響，結果發現，采用微波解凍方式，其持水性最低。ANESE 等[16]研究也發現，凍藏中魚肉的持水性與硬度存在一定的正相關關系，本研究也得出類似的結論。

2.4 不同凍結與解凍方式對凝膠主要作用力分析

凝膠形成三維網狀結構是蛋白質與蛋白質、蛋白質與水分子之間的二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用之間的作用力達到平衡的結果[17]。JIANG 等[18]報道，凝膠中添加不同的變性劑，能夠溶解形成凝膠的蛋白，進而確認維持凝膠穩定的分子間作用力。尿素會破壞凝膠的氫鍵作用，SDS 破壞的是疏水相互作用，β- 巰基乙醇破壞的是二硫鍵。經冷凍再解凍后的肌原纖維蛋白凝膠在不同變性劑中溶解度如圖4～6 所示。

從圖4～6 可以看出，經不同凍結和解凍處理的肌原纖維蛋白形成的凝膠中氫鍵和疏水相互作用與對照組相比，均呈現下降趨勢，且以- 18 ℃凍結微波解凍的處理組，對氫鍵和疏水相互作用破壞最為顯著（P＜0.05），可能是由于該處理方式造成了肌原纖維蛋白的顯著變性，這一結果與上述該處理的肌原纖維蛋白形成的凝膠的持水性和凝膠強度下降一致。從圖6 可以看出，經不同處理的肌原纖維蛋白，其二硫鍵含量均高于對照組，這可能是由于不同處理使蛋白質中的巰基轉化成了二硫鍵。同時，蛋白質凝膠在尿素變性劑中的溶解度相對于其他2 種變性劑較小，說明氫鍵對維持經凍結及解凍處理后的肌原纖維熱誘導凝膠的貢獻較小，而疏水相互作用和二硫鍵交聯對分子構象的改變和蛋白分子聚集起主要作用，是凝膠形成的主要作用力。

3 結論

在不同凍結與解凍方式下肌原纖維蛋白的凝膠特性及凝膠分子間的作用力均發生了變化，表現出凝膠強度、白度及持水性降低，采用- 18 ℃凍結、微波解凍的肌原纖維蛋白與未經處理的對照組相比，各理化指標下降最為明顯；而采用- 50 ℃凍結、4 ℃解凍的肌原纖維蛋白含量較高且凝膠特性保持較好。同時，凝膠分子間的作用力分析表明，疏水相互作用和二硫鍵是凝膠形成的主要作用力。因此，在加工、貯藏和運輸環節中，盡可能采用較低的溫度凍結和低溫緩慢解凍，才能夠有效保持肌原纖維蛋白的凝膠特性。