新型vip3Aa 基因的克隆表達及活性分析

關 鵬，代小娟，秦培剛，宋金東，賀志有

（1.渭南職業技術學院農學院，陜西渭南714026；2.新疆醫科大學基礎醫學部，新疆烏魯木齊830011）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是全球應用非常廣泛的一種微生物殺蟲劑，其在生長過程中能產生多種對不同害蟲具有特異性殺蟲活性的毒素，如分泌期殺蟲蛋白（Secreted insecticidal proteins，SIPs）、殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs，又稱伴胞晶體蛋白）及營養期殺蟲蛋白（Vegetative insecticidal proteins，VIPs）等[1-4]。Vip蛋白是Bt 菌株在營養期產生的，其序列是與殺蟲晶體蛋白（Cry 和Cyt）完全不同的一類毒蛋白，對鱗翅目、半翅目、鞘翅目等多種害蟲具有特異性殺蟲活性[5-9]，因此，vip 基因資源的挖掘一直是國內外Bt研究的熱點之一。

目前，已發現的Vip 蛋白共有147 個（截至2019 年4 月10 日），根據國際Bt 營養期殺蟲蛋白的命名原則，將這些蛋白分為Vip1、Vip2、Vip3 和Vip4 四大類。其中，Vip1 和Vip2 可形成二元毒蛋白，對鞘翅目和半翅目害蟲具有特異性殺蟲活性[7-8]；Vip3 蛋白數量最多，分為Vip3A、Vip3B 和Vip3C等3 個亞類，共111 個，其對鱗翅目害蟲具有特異性殺蟲活性；Vip4 蛋白僅有一個，其殺蟲活性尚不明確。在Vip3A 亞類中Vip3Aa 類蛋白數量最多，共66 個，這些蛋白之間同源性均在95%以上，但是序列中個別氨基酸的差異對不同Vip3Aa 類蛋白在殺蟲譜和殺蟲毒力方面都具有顯著影響[10-12]。因此，對每個新型vip3Aa 類基因編碼蛋白的殺蟲活性研究具有非常重要的意義。

Bt TB22- 5 是從太白山森林土壤中分離得到的，能產生菱形伴胞晶體，是對鱗翅目的棉鈴蟲、甜菜夜蛾具有明顯殺蟲活性的菌株。本研究采用多對vip 基因通用引物對該菌株中vip 型基因進行鑒定，獲得一個新型vip3Aa 類基因片段，通過對其全長序列的克隆及原核表達，并進一步研究表達蛋白的殺蟲活性，旨在明確該新型vip3Aa 基因的殺蟲活性，為其應用在農業害蟲的生物防治中提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 野生型Bt TB22- 5 菌株、大腸桿菌DH5α 感受態細胞均保存于渭南職業技術學院農學院微生物實驗室。

1.1.2 測試昆蟲 棉鈴蟲和甜菜夜蛾標準化測試幼蟲均飼養于渭南職業技術學院農學院微生物實驗室。

1.1.3 培養基 蛋白胨和NaCl 各10 g，酵母提取物5 g，用無菌水定容至1 L，即做成LB 液體培養基；在LB 液體培養基中加入1.5% 瓊脂粉即可做成LB固體培養基。

1.1.4 試劑 T4 DNA 連接酶、DNA 和蛋白質Marker、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素、X- gal、IPTG、PCR SuperMix 均購自北京全式金生物技術有限公司；Axygen 質粒提取試劑盒及DNA 凝膠回收試劑盒均購于上海百賽生物技術有限公司；pMD19- T載體購自日本TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 Bt TB22- 5 質粒的提取及vip3A 基因的鑒定參照REYES- RAMíREZ 等[13]的方法對Bt TB22- 5菌株中質粒DNA 進行提取。使用表1 中vip 通用引物對Bt TB22- 5 菌株的vip 基因進行PCR 鑒定。vip1- F 和vip1- R、vip2- F 和vip2- R 引 物 序 列 及PCR 反應條件參照HERNáNDEZ- RODRíQUEZ等[14]的 方 法；vip3- 1F 和vip3- 1R、vip3- 2F 和vip3- 2R引物序列及PCR 反應條件參照FANG 等[15]的方法。若鑒定vip3 型基因的2 對引物均能擴增出與其預測大小一致的產物，表明該擴增片段與vip3Aa1 基因具有高度相似性；如果僅有1 對引物擴增出與其預測大小一致的產物，則表明擴增片段是一個序列同源性較低的新型vip3 基因[12，15]。擴增產物經電泳檢測及凝膠回收后，送深圳華大基因科技有限公司進行測序。

表1 vip 基因鑒定的通用引物

1.2.2 vip3Aa 基因的全長克隆及測序 鑒定獲得的vip 基因片段經NCBI BlastX 在線分析工具比對分析后，設計并合成引物vip3Aa- F（5′- ATGAACAA GAATAATACTAAATT - 3′）和vip3Aa- R（5′- TTAC TTAATAGAGACATCGTAA - 3′） 用于vip 基因的全長擴增。擴增產物與克隆載體pMD19- T 連接形成重組子，經大腸桿菌DH5α 轉化后，對陽性單克隆中的插入基因序列進行測序分析。

1.2.3 vip3Aa 基因的生物信息學分析 在NCBI數據庫中使用BLASTx 工具對vip3Aa 基因序列的同源性進行分析；運用Vector NTI Advance 11 和DNAStar 生物信息學分析軟件對vip3Aa 基因與其同源序列進行序列比對；以pET- 28a 為大腸桿菌表達載體，vip3Aa 基因表達載體構建的酶切位點設計，以及編碼蛋白的序列同源性分析均采用DNAMAN 7.0.2.176 軟件進行。

1.2.4 vip3Aa66 基因的表達及檢測 以Bt TB22- 5質粒DNA 為模板，采用引物vip3Aa66- F：5′- CGCATGAACAAGAATAATACTAAATT- 3′（ 下劃線部分為酶切位點：BamH I） 和vip3Aa66- R：5′-GCTTACTTAATAGAGACATCGTAA- 3′（下劃線部分為酶切位點：Sal I） 對vip3Aa66 基因進行PCR 擴增。將擴增產物和pET- 28a 載體分別經過BamH I 和Sal I 雙酶切后，經T4 連接酶連接后，得到重組質粒pET- vip3Aa66；重組質粒通過大腸桿菌DH5α 轉化，篩選陽性單克隆，用BamH I 和Sal I內切酶對重組質粒進行驗證；最后，重組質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）中，并加入100 mL LB 液體培養基（含100 μg/mL 卡那霉素），在37 ℃180 r/min搖床中培養過夜。吸取5 mL 培養液加入到500 mL新鮮的無菌LB 液體培養基（含100 μg/mL 卡那霉素）中，在37 ℃180 r/min 下培養至菌液OD600值為1.6～1.8 時，加入500 μL 1 mol/mL IPTG 溶液后誘導表達8 h。培養產物經4 ℃5 000×g 離心10 min后，棄上清，沉淀于- 20 ℃保存備用。同時，空載pET- 28a 質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）中經上述方法誘導表達后作為陰性對照。表達產物的SDSPAGE 蛋白電泳檢測參照SCH?GGER 等[16]的方法進行。

1.2.5 Vip3Aa66 蛋白殺蟲活性測定 對Vip3Aa66表達蛋白粗提物稱質量，然后加入10 mL 無菌水，振蕩混勻后，懸液經梯度稀釋法依次稀釋成5，10，20，40，80，160，320 μg/mL 共7 組不同濃度的樣品，等量的每組樣品分別加入到適量養蟲飼料中混勻，然后分別裝入到12 孔培養板中。每孔中放入大小相同的二齡期幼蟲2 頭，每組樣品3 次重復。同時以野生型Bt TB22- 5 菌株作為陽性對照，以加無菌水的飼料以及空載pET- 28a 質粒在大腸桿菌BL21（DE3） 中表達的粗提物作為陰性對照。28 ℃飼養7～10 d 后統計試驗結果。

1.3 數據分析

殺蟲活性測定數據經SPSS 10.0 軟件分析，計算LC50值。

2 結果與分析

2.1 Bt TB22-5 菌株中vip 基因的鑒定

電泳檢測結果表明，vip1- F 和vip1- R、vip2- F和vip2- R 引物擴增產物大小均約為150 bp，這與預測的擴增片段大小不相同；vip3- 1F 和vip3- 1R引物擴增產物約為450 bp，vip3- 2F 和vip3- 2R 引物擴增產物約為360 bp，這2 對引物擴增結果與預測的擴增片段大小一致（圖1）。由此可推測，Bt TB22- 5 菌株中含有一個與vip3Aa1 基因同源性較高的vip3 型基因。通過對這2 個vip3 型基因鑒定片段的測序分析表明，其與vip3Aa1 基因的序列同源性分別為98.9%和99.5%。結果表明，Bt TB22- 5菌株中含有一個vip3Aa 型基因片段。

2.2 Bt TB22-5 菌株中vip3Aa 型基因的全長克隆及其序列分析

利用vip3Aa- F 和vip3Aa- R 引物對vip3Aa 型基因的全長序列進行擴增，擴增結果檢測表明，PCR 產物大小約為2.4 kb（圖2）。測序結果分析表明，該基因總長2 370 bp，其推導的編碼蛋白由790 個氨基酸組成，分子量約為88.5 ku，等電點為5.02。Vip3Aa 類蛋白序列比對分析表明，該Vip3Aa 蛋白與已知的Vip3Aa9 蛋白質序列具有最高的序列同源性（99.1%），二者之間僅有4 個氨基酸不同（圖3）。根據國際Bt 殺蟲晶體蛋白基因的命名規則，該基因被正式命名為vip3Aa66 （GenBank 登錄號為MK252100）。

2.3 vip3Aa66 基因的原核表達

表達產物的SDS- PAGE 分析表明，vip3Aa66基因表達約89 ku 大小的產物（圖4），這與預測的vip3Aa66 基因編碼蛋白質分子量大小相一致。

2.4 vip3Aa66 表達蛋白粗提物的生物活性分析

生物活性測定分析表明，vip3Aa66 基因表達蛋白粗提物對甜菜夜蛾幼蟲具有較高的殺蟲活性，其LC50值為23.75 μg/mL；對鱗翅目的棉鈴蟲幼蟲殺蟲活性較低，其LC50值為243.87 μg/mL。然而，與野生型Bt TB22- 5 菌株相比，vip3Aa66 基因表達產物的殺蟲活性明顯較低（表2）。

表2 vip3Aa66 表達蛋白粗提物對2 種鱗翅目幼蟲的生物活性測定結果μg/mL

3 結論與討論

Bt 是目前應用最為廣泛的一種微生物殺蟲劑，其內生質粒中攜帶的伴胞晶體蛋白編碼基因（cry和cyt）被大量克隆并已應用在農林、衛生等害蟲的生物防治中。然而，隨著單一Bt 菌株或殺蟲基因的長期使用，造成害蟲耐藥性不斷出現，其防治效果日益降低[17]。因此，挖掘新的Bt 菌株資源、克隆新型殺蟲功能基因成為解決害蟲耐藥性問題的有效手段。Vip 蛋白是Bt 菌株在營養期產生的一類對多種昆蟲具有特異殺蟲活性的、完全不同于Cry 蛋白的一類殺蟲蛋白，而且Vip 和Cry 蛋白之間的交叉抗性極低[18]。因此，vip 基因作為一種新的殺蟲基因資源，可成為cry 基因的替代品，有效延緩害蟲耐藥性的出現。

在已報道的Vip3Aa 類蛋白中，Vip3Aa11、Vip3Aa39、Vip3Aa46、Vip3Aa58、Vip3Aa59、Vip3Aa-60、Vip3Aa61 等蛋白對甜菜夜蛾幼蟲均具有殺蟲活性[6，11-12，19-20]。本研究表明，Vip3Aa66 蛋白與Vip3Aa類蛋白之間序列差異性極小，但是它們對甜菜夜蛾幼蟲的殺蟲活性卻差異明顯，甚至有些Vip3Aa 類蛋白具有更廣泛的殺蟲譜，如Vip3Aa39 蛋白對小地老虎（Agrotis ipsilon）幼蟲也具有明顯的殺蟲活性[11]；亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis） 幼蟲對Vip3Aa46蛋白敏感[19]；Vip3Aa58 和Vip3Aa59 蛋白均對蘋果蠹蛾（cydia pomonella）有一定的殺蟲活性[12]。因此，vip3Aa66 作為一個新型vip3Aa 基因，對其表達蛋白進行生物活性研究顯得尤為重要。

之前殺蟲活性分析表明，野生型Bt TB22- 5 菌株對棉鈴蟲和甜菜夜蛾幼蟲的殺蟲活性明顯高于Vip3Aa66 蛋白，其原因可能是由于產伴胞晶體的Bt TB22- 5 菌株表達某些Cry 或Cyt 蛋白，或者產生某些其他的毒蛋白，這些毒蛋白之間有可能產生協同增效的作用。因此，在后續的研究中，將對Bt TB22- 5 菌株中其他殺蟲基因進行研究，為該菌株在農業害蟲的生物防治提供理論依據。