高粱抗絲黑穗病菌4 號生理小種SRAP 標記分析

司浩浩，段永紅，孫 毅，張歡歡，張 旭

（山西農業大學農學院，山西太谷030801）

高粱絲黑穗病是一種對作物生產有嚴重影響的病害[1-3]，是全世界普遍存在的重要高粱病害，該病會對高粱穗部的結構造成破壞，導致高粱減產，甚至會造成顆粒無收[4]。在我國北方地區，尤其是內蒙古和東北三省，絲黑穗病已經成為一種常見病害，嚴重影響高粱的生產效益[5-6]。因此，高粱絲黑穗病的防治對高粱的安全生產具有重要意義。

高粱絲黑穗病是由孢堆黑粉菌引起的，一般在抽穗期時才能觀察到病癥，病癥最直觀的癥狀是果穗部全部或者大片地變成黑粉狀，病株明顯比其他植株矮小。其中，發病初期的癥狀是穗部的下部膨大，打開穗葉后可以觀察到白色的棒狀物，叫作“烏米”；發病中期，烏米會變大、變硬；發病后期，烏米由白轉黑，開始出現黑色絲狀物和黑粉，不僅使穗部受損顆粒無收，而且也會感染葉子，使葉子產生條斑，影響植物光合作用，進而影響植物生長。有學者研究認為，高粱絲黑穗病菌不存在分化[7]，但國內外許多研究也發現，高粱絲黑穗病菌包括多個類型，而且分化程度逐漸增大[8-11]。病菌的分化趨勢使作物對病菌的抗性減弱，需要不斷培育新的抗病品種。

高粱絲黑穗病菌具有顯著的分化趨勢，新的生理小種的出現會大大降低原有抗病品種的抗性，對高粱收獲造成新的威脅。張福耀等[12]研究發現了高粱絲黑穗病菌4 號生理小種，該小種給高粱育種和生產帶來嚴重損失，研究高粱絲黑穗病4 號生理小種相關抗性基因的遺傳規律顯得尤為重要，急需篩選與抗性基因相關的連鎖標記，明確其遺傳規律。

本研究選用高粱感病品種三尺三和抗病品系961541 作為試驗材料，采用SRAP 標記，從分子水平分析感病植株與抗病植株基因組差異，旨在實現分子標記輔助育種。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗在山西農業大學農作站進行，于2015 年以961541 品系（對1，2，3，4 號生理小種均表現免疫）為母本、以三尺三為父本進行雜交獲得雜交種F1，經海南加代獲得F2群體。961541 品系和三尺三由山西農業科學院生物技術研究中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 接菌 將高粱父母本及F1、F2群體采用菌土接菌法播種于山西農業大學農作站，于高粱抽穗期調查高粱的感染情況，并計算發病率。

1.2.2 DNA 提取 在苗期對高粱親本及211 個F2群體單株采樣，用CTAB 法（十六烷基三甲基溴化銨法）[13-15]對各單株進行基因組DNA 提取（其基本原理是用物理方法破碎植物細胞，加入CTAB 緩沖液將DNA 溶解出來，再用氯仿- 異戊醇抽提去除蛋白質，最終得到DNA）。CTAB 緩沖液包括4 種主要試劑：12.5 mmol/L 的PEX，100 mmol/L 的Tris- HCl（pH＝8.0），10mmol/L的EDTA（pH＝8.0）和700mmol/L 的NaCl。最后將提取的DNA 溶于適量的TE（pH＝8.0）緩沖液中，于- 70 ℃冰柜中保存。

1.2.3 抗感池的構建 采用分離群體混合分析法（BSA）建立抗感池。根據F2群體單株發病情況，挑選抗病株、感病株各15 株，提取其基因組DNA 后等量混合。分離群體混合分析法是利用相對或極端差異性狀進行功能基因挖掘的一種方法，其基本原理是在分離群體中只對目標性狀的表現型進行分類，在數量達到一定程度后，抗感池間整體差異最顯著的基因即與目標性狀連鎖的分子標記。

1.2.4 檢測DNA 的濃度和純度 取5 μL 的DNA溶液，用核酸蛋白檢測儀測定高粱DNA 的A260/A280值，即得DNA 的純度和濃度；并用瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA 的質量。

1.2.5 SRAP 標記所用引物來源 17 對上、下游SRAP 引物由上海生工合成，其序列如表1 所示。

表1 SRAP 標記的引物序列

1.2.6 SRAP 標記的擴增 PCR 擴增反應在EDC-810 型基因擴增儀上進行。SRAP- PCR 的最適反應體系（10 μL） 為：DNA 模板1.0 μL、10×PCR Buffer 1.0 μL、Taq DNA 聚合酶0.2 μL、dNTPs 1.0 μL、上下游引物各0.3 μL，ddH2O 6.2 μL。SRAP 的操作過程為：在94 ℃下預變性3 min；在94 ℃下變性1 min，在57 ℃下退火45 s，在72 ℃下延伸1 min，循環35 次；在72 ℃延伸10 min，于4 ℃下保存。

1.2.7 聚丙烯酰胺凝膠板的制備 先將沖洗干凈的用于制備凝膠板的2 塊玻璃板烘干，2 塊成對插入膠條中，并固定在電泳儀上，用1.5%的瓊脂糖凝膠封膠，靜置數分鐘待其凝固；然后將制備好的8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（30%非變性聚丙烯酰胺凝膠貯液11 mL；10×TBE 溶液4 mL；雙蒸水26 mL；10%的APS 溶液267 μL；TEMED 67 μL）加入燒杯，用玻璃棒攪拌使其充分混勻；最后將其注入到封好口的玻璃板中，插入合適寬度的梳子，豎直放置，直到徹底凝固。

1.2.8 SRAP 標記電泳顯色 其參照王運斌等[16]的顯色方法進行，在具體的步驟中有所改進。以Marker 為對照，用8%的聚丙烯酰胺凝膠對擴增產物進行電泳檢測，200 V 恒壓下電泳40 min，然后銀染顯色，使帶在膠板上清晰可讀。

1.2.9 擴增產物測序與引物DNA 序列比對 在紫外燈下快速將差異片段切下，將DNA 從膠中分離出來，分別以2 個引物采用Sanger 法進行測序。

1.3 數據分析

試驗數據采用Excel 2003 進行常規計算和統計分析。

2 結果與分析

2.1 田間調查數據分析

田間調查結果顯示（表2），種植的三尺三/961541組合中，感病親本三尺三的發病率為37.5%，抗病親本961541 的發病率為0，F1的發病率為0；田間種植的F2群體共211 株，其中，感病植株16 株，抗病植株195 株，發病率為7.58%，F2的發病率比較接近1/16，推測4 號生理小種可能受2 對非等位基因控制。適合性檢驗結果表明（表3），抗感植株比率接近15∶1，χ2值分別是0.027，0.406（P＞0.05），說明高粱絲黑穗病4 號生理小種的抗性受2 對基因控制。

表2 親本及F2 群體的絲黑穗侵染鑒定

表3 F2 群體性狀分離比的適合性檢驗

2.2 高粱SRAP 標記分析

2.2.1 高粱親本間多態性引物篩選 所用的289 對SRAP 引物中有119 對引物在親本間表現差異，多態性引物的總比率為41.18%，119 對引物條帶平均多態性比率為37.27%（表4）。其中，引物Em4/Me6 在親本間擴增的電泳結果如圖1 所示。

表4 親本間引物擴增的多態性

續表4

2.2.2 高粱抗感池間多態性引物篩選 用篩選出的119 對引物在F2構建的抗感池中繼續篩選得出，119 對引物中共有9 對引物在抗感池間表現出差異，多態性引物的總比率為7.56%，9 對引物條帶的平均多態性比率為53.52%（表5）。

表5 抗感池間引物擴增的多態性

引物Em4/Me6 在抗感池間擴增的電泳結果如圖2 所示。

2.2.3 高粱抗感單株間多態性引物驗證 用篩選出的9 對引物分別在15 個感病單株DNA 和15 個抗病單株DNA 中進行篩選，結果僅有1 對SRAP引物Em4/Me6 存在差異，多態性引物的比率為11.11%。

引物Em4/Me6 在抗感病單株中擴增的電泳結果如圖3 所示。

2.2.4 SRAP 標記篩選結果 選用親本間有多態性的引物在F2構建的抗感池中繼續篩選，篩選出9 對多態性引物在抗感池間有差異；隨后用F2單株DNA 驗證，結果僅有1 對SRAP 引物Em4/Me6 存在差異。其中，抗池的條帶帶型與母本961541 相同，感池的條帶帶型與父本三尺三相同。對上述SRAP 差異片段回收產物進行測序，未成功。失敗的原因可能主要是由于DNA 保存時間過長，造成DNA 降解。

3 結論與討論

3.1 高粱抗絲黑穗病基因遺傳規律探討

目前，已有學者選用RAPD、SSR 等標記研究高粱絲黑穗抗性基因，并得到了不同的研究結果。鄒劍秋等[17]采用SSR 技術對3 號生理小種進行研究，結果表明，該小種符合質量性狀遺傳規律，抗病性受2 對非等位基因控制，并且存在基因互作，篩選出的2 個抗性標記分別位于高粱第2 號、6 號染色體上。OHBJ 等[18]研究表明，美國5 號生理小種的抗病基因位于第8 號染色體上，受1 對基因控制。姜鈺等[19]研究表明，3 號生理小種的抗病基因位于第3 號染色體上，抗病性為顯性，抗病性受1 對非等位基因控制，抗性差異片段大小約為230 bp。白春明等[3]用SLAF 標記測序和236 個自然群體抗病性鑒定表型，進行了全基因組范圍SNP 關聯分析，結果表明，主要抗病位點位于第8 號染色體上。

本研究經過親本間、基因池、單株的共同篩選驗證，初步篩選到1 個與抗絲黑穗病相關的SRAP標記，差異片段大小約為250 bp，但由于缺乏錨定標記，沒有將差異標記定位到染色體上。本試驗結果表明，高粱絲黑穗病4 號生理小種的抗病性受2 對非等位基因控制，符合質量性狀遺傳，抗病性是顯性，感病性是隱性，與楊慧勇等[20]的研究結果相近。但也有學者研究認為，高粱抗絲黑穗病由數量性狀遺傳控制，還有加性、顯性和上位等效應的微弱作用，高粱絲黑穗病菌有多個類型，而且具有嚴重的分化趨勢，其遺傳規律仍有待進一步研究。

本試驗用4 號生理小種對高粱種質961541 抗病性的研究完善了我國高粱絲黑穗病菌生理小種鑒別寄主體系。眾多研究結果顯示，不同材料對不同生理小種的抗病基因位點明顯不同。所以，今后應該緊密結合分子標記和田間育種，選擇更多高粱品種進行雜交，并分析其抗病基因，從而提高品種抗性和育種效率。

3.2 SRAP 篩選與高粱抗絲黑穗病相關標記的實用性分析

LI 等[21]篩選到1 個與中國白菜雄性不育基因相關的SRAP 標記、1 個與油菜恢復基因連鎖的SRAP 標記和1 個與芹菜病毒抗性基因緊密連鎖的SRAP 標記。潘俊松等[22]采用SRAP 標記方法將黃瓜始花節位性狀控制基因定位在第IX 連鎖群上。SRAP 標記具有簡便、穩定、中等產率、在基因組中分布均勻的特點，已經被應用于水稻、棉花、油菜、馬鈴薯、蘋果、柑橘類果樹、櫻桃、梅子、大蒜、萵苣及芹菜等植物的研究中[23-27]。本研究選用SRAP 技術初步篩選到1 個與高粱抗絲黑穗病相關的SRAP標記，差異片段大小約為250 bp，實現了在實驗室內快速鑒定高粱抗絲黑穗病病株。