紅葡萄酒中蘋果酸測定方法的比較

趙永春，袁猛，袁曉林，車兆虹，田寶榮（中國長城葡萄酒有限公司，河北懷來 075400）

蘋果酸-乳酸發酵（Malolactic Fermentation，MLF）是在乳酸菌的作用下將蘋果酸分解成乳酸和CO2的過程。這一過程使新葡萄酒的酸澀和粗糙感消失，而變得柔順、舒軟。經蘋果酸-乳酸發酵后的紅葡萄酒，酸度降低，果香、醇香變濃，呈現柔軟、有皮肉和肥碩等特點，質量提高[1]。同時蘋果酸-乳酸發酵還能增強葡萄酒的生物穩定性。自發MLF或野生乳酸菌容易導致品種香氣損失，產生還原性氣味等而降低酒品質量，隨著葡萄酒消費需求的劇增和消費者對酒品品質要求的不斷提高，各國釀酒師已意識到進行蘋乳發酵對改善葡萄酒品質的重要性，釀酒師常常會添加乳酸菌啟動MLF，因此如何判斷蘋乳發酵結束時間，及時做到控制發酵進程顯得尤為重要[2-3]。而以蘋果酸的含量作為指標檢測控制蘋乳發酵進程具有重要的意義。

目前，蘋果酸的檢測方法主要有紙層析法、液相色譜法、酶法、光譜法等，傳統方法是采用紙層析法來判斷蘋乳發酵的進程。紙層析法主要依據蘋果酸在展開劑中的移動速度來判斷，通過觀察濾紙上蘋果酸顯色斑點的大小直觀判斷蘋乳發酵進程。該法耗時較長，且平行性、定量性較差，對生產會造成一定延誤，而且所用的有機溶劑等常具有揮發性，并有一定毒性。液相色譜法具有快速、靈敏、重現性好等優點，但對實驗設備要求高。酶法測定快速、簡便、特異性良好，在國外已得到廣泛應用[4-7]。光譜法測速快、易操作、污染小[8]，故本文將光譜法和酶法與紙層析法進行了比較，以此替代紙層析法來判斷蘋乳發酵的結束時點。

FOSS公司的葡萄酒全分析儀WineScan? Flex（以下簡稱FOSS儀）可以測試多類型的樣品，包括發酵的葡萄汁、葡萄原酒和成品葡萄酒。FOSS儀采用了FTIR傅里葉變換紅外光譜技術，快速分析出葡萄酒中的多項指標，包括酒精度、還原糖、葡萄糖、果糖、總酸、揮發酸、pH、蘋果酸、乳酸等指標[9]。

Y15主要是通過酶反應原理測定蘋果酸的含量。樣品中的蘋果酸通過反應產生NADH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），因為NADH生成量與蘋果酸含量呈正比，且在340 nm處有吸收峰，故通過分光光度計測定NADH的生成量，計算蘋果酸含量[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

沙城產區‘赤霞珠’干紅葡萄酒。

1.2 儀器與設備

WineScan? Flex葡萄酒成分快速分析儀（丹麥F O S S 公司）；Y 1 5分析儀（Biosystems公司）；濾紙沃特曼1號或新華1號；層析缸；微量取樣器等。

1.3 方法

1.3.1 試劑的配置

50%乙酸；溴酚藍的丁醇液：在1 L丁醇中加入1 g溴酚藍溶解后（不能加熱）即得到溴酚藍的丁醇溶液；展開劑：取50 mL溴酚藍丁醇液與25 mL 50%乙酸混合即得到展開劑。

1.3.2 蘋果酸的測定

（1）層析法測定蘋果酸[10]。

（2）FOSS測定蘋果酸。將酒樣倒入10 mL試管中，按儀器操作說明進行操作，測出結果并記錄。

（3）Y15測定蘋果酸。按儀器說明說將酒樣和試劑盒放入儀器中，按照程序測定，記錄結果。

1.3.3 紙層析法結果判斷

在藍紫色的底面上有黃色的斑點，酒石酸的速度慢，在最下方；乳酸和琥珀酸的速度最快，被推動劑帶到濾紙的頂端，蘋果酸則處于它們兩者之間。如果應在蘋果酸出現的位置上沒有黃色斑點，而在乳酸的位置處有明顯的黃色斑點則表示蘋果酸-乳酸發酵已經完成；反之，如果在蘋果酸出現的位置上有黃色斑點，而在乳酸的位置處沒有黃色斑點，則表示蘋果酸-乳酸發酵尚未開始；對于蘋果酸和乳酸的位置上均有黃色斑點則說明蘋果酸-乳酸發酵正在進行中，還尚未完成。試驗所得數據采用SPSS 21.0數據處理系統進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 FOSS分析結果與紙層析法結果的比較

根據實踐經驗，發現FOSS儀檢測結果蘋果酸含量≤0.6 g/L時，紙層析法檢驗結果為蘋乳發酵結束；而＞0.6 g/L時，紙層析法檢測蘋乳發酵還未結束。為了進一步驗證該結果是否具有可靠性，將檢驗結果通過SPSS 21.0數據處理系統進行卡方分析。結果見表1與表2。

表1 蘋果酸含量分組結果（交叉制表）Table 1 Results of malic acid content grouping (cross tabulation)

表2 卡方檢驗Table 2 Chi-square tests

試驗共測定82個樣本，樣本量N＞40，且交叉表中每個單元格中期望計數大于5，卡方檢驗結果是精確的，可以參考表2第一行的指標，Pearson卡方顯著性值為0.000，小于0.05，表明差異顯著，說明蘋果酸含量在＞0.6 g/L和≤0.6 g/L的差異具有統計學意義，即兩個組之間具有差異，說明0.6 g/L是蘋乳發酵是否結束的分界點。既可以用FOSS測出的結果≤0.6 g/L來表明蘋乳發酵結束。以此來代替紙層析法。

2.2 Y15分析結果與紙層析法的比較

根據實踐經驗發現，Y15檢測結果蘋果酸含量為≤0.4 g/L時，紙層析法檢驗結果為蘋乳發酵結束；而＞0.4 g/L時，紙層析法檢測蘋乳發酵還未結束。為了進一步驗證該結果是否具有可靠性，將檢驗結果通過SPSS 21.0數據處理系統進行卡方分析。結果見表3和表4。

表3 蘋果酸含量分組結果（交叉制表）Table 3 Results of malic acid content grouping (cross tabulation)

試驗共測定了82個樣本，樣本量N＞40，且交叉表中每個單元格中頻數均大于5，卡方檢驗結果是精確的，可以參考表4第一行的指標，Pearson卡方顯著性值為0.000，小于0.05，表明差異顯著，說明蘋果酸含量在＞0.4 g/L和≤0.4 g/L的差異具有統計學意義，即兩個組之間具有差異，說明0.4 g/L是蘋乳發酵是否結束的分界點。既可以用Y15測出的結果≤0.4 g/L來表明蘋乳發酵結束。以此來代替紙層析法。

2.3 FOSS測定結果和Y15測定結果相關性分析

檢驗結果通過SPSS 21.0數據處理系統分析得到表5。由表5得出，FOSS和Y15所測結果顯著相關，相關系數為0.983。說明FOSS和Y15所測結果具有統計學意義上的相關性。

表4 卡方檢驗Table 4 Chi-square tests

表5 FOSS和Y15方法的相關性分析Table 5 Correlation analysis of FOSS and Y15 methods

3 討論與結論

采用紙層析法測定蘋乳發酵結束的樣本，其用FOSS測定蘋果酸含量結果都在0～0.6 g/L范圍；用Y15測定蘋果酸含量結果在0～0.4 g/L，且FOSS與Y15分析結果具有相關性。采用FTIR傅里葉變換紅外光譜技術，不需特殊處理樣品，也不消耗有毒試劑，簡化了常規分析程序，該方法使檢驗人員遠離化學有害物質，降低了危險性，減少環境污染。最為重要的是，FOSS和Y15檢驗時間均能大大縮短，FOSS測定只需30 s，Y15檢測約需10 min，而紙層析則需要長達10 h的反應時間，且兩方法特異性好、操作簡便，因此可采用F0SS和Y15檢測的方法來監測生產過程中蘋果酸的含量，代替紙層析法判斷MLF結束。當FOSS儀（或Y15）檢測結果蘋果酸含量≤0.6 g/L（或≤0.4 g/L）時，即可判定為MLF結束，能及時反映產品狀況，滿足生產需要，改善因耗時長而帶來的延誤，達到改善葡萄酒風味的目的。