箭筈豌豆新品種DUS測試指南研制—測試性狀評價和參照品種篩選

閔學陽，劉文獻，王彥榮*，林曉珊，齊曉，張正社，聶斌

(1.蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院， 甘肅 蘭州 730020；2.全國畜牧總站，全國草品種審定委員會辦公室，北京 100125)

植物新品種保護制度是農業領域所特有的一項重要知識產權制度，對鼓勵種業投資、激勵育種創新、加速植物新品種轉化運用具有不可替代的作用[1-2]。《國際植物新品種保護公約》(The International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV公約)的保護形式是對符合特異性(distinctness)、一致性(uniformity)、穩定性(stability)(簡稱 DUS )測試要求的植物新品種授予保護，以保護育種者權利[3]。截止2019年4月10日，我國已公布了21項DUS測試國家標準和177項DUS測試行業標準，其中花卉為40(23%)項、蔬菜為38(21%)項、大田作物為32(18%)項、果樹為26(15%)項、牧草為12(7%)項、藥用植物為10(6%)項，菌類為7(4%)項、其他12(7%)項(http://www.nybkjfzzx.cn/p_duscs/duscs.aspx)。總體而言，自1991年開始實施植物新品種保護制度以來，我國DUS測試經歷了從無到有、從少到多、從弱到強的發展過程，整體呈現快速發展的態勢。

我國新頒布的《中華人民共和國種子法》[4]規定，2016年1月1日以后申請的植物新品種應滿足特異性、一致性、穩定性3個要求。2017年，農業農村部共受理國內外品種權申請3842件，位居UPOV成員第一位，標志著我國已成為植物新品種保護大國(http://www.moa.gov.cn/)。因此，DUS 測試無論在品種審定、登記還是保護中都起著重要作用，對于提升我國育種水平和促進育種原始創新都具有積極的推動作用。

DUS測試指南的主要內容包括：總體技術要求(適用對象、繁殖材料的要求、測試安排、性狀的觀測與評價、分組性狀和性狀及符號)、性狀表、性狀解釋、附錄A性狀表、附錄B性狀表的解釋、附錄C技術問卷等內容。其中，性狀表的確定是DUS測試指南研制的核心內容，是判別申請品種是否具備三性的主要依據[3,5-6]。完整的性狀表應由表達類型、表達狀態、觀測時期/方法/樣本量、參照品種和每個表達狀態對應的數字代碼等部分組成。性狀表達類型分為質量性狀、數量性狀和假質量性狀；觀測方法和記錄類型包括：群體目測、個體目測、群體測量和個體測量。參照品種的恰當選擇與確定，在判定參試品種是否具備特異性中發揮重要作用，可為性狀的表達狀態提供實例參考，降低測試員主觀觀測的誤差，從而提高性狀觀測的準確性和客觀性。因此，測試性狀評價和參照品種篩選在DUS測試指南研制中起著舉足輕重的作用。

箭筈豌豆(Viciasativa)是豆科野豌豆屬一年生優質牧草，具有適應性廣、營養價值高、適口性好等特性，普遍種植于我國長江中下游、華北和西北等省(區)[7-9]。另外，作為適宜高寒高海拔地區栽培的優良牧草，箭筈豌豆還可通過與燕麥(Arenasativa)混播，調制青干草，用于冬春補飼，是解決高山草原牧區家畜營養不足的有效措施，在我國草地農業系統中發揮著重要作用[10-11]。我國已培育出多個箭筈豌豆品種，例如，20世紀80年代，中國農業科學院蘭州畜牧研究所育成的“333/A”箭筈豌豆具有早熟、耐旱、子實產量高、不裂莢等特點；90年代，江蘇省農業科學院土壤肥料研究所育成的“6625”和“蘇箭3號”箭筈豌豆，具有早熟、適應性廣等特點。近年來，蘭州大學先后育成了針對青藏高原的系列品種，其中2014年審定登記的“蘭箭3號”具有生育期短、種子產量高，種植范圍可覆蓋青藏高原海拔4000 m及以下地區等優勢；2014年審定登記的“蘭箭1號”，具有牧草產量高，可在海拔3000 m及以下地區生產種子等特點；2015年審定登記的“蘭箭2號”，具有牧草和種子產量均較高的特點，可在青藏高原海拔3500 m及以下地區生產種子，該品種已列為農業農村部主推品種之一。2019年中央一號文件明確提出“加快選育和推廣優質草種”，這是根據我國草種業發展現狀做出的決策。伴隨著培育高產量、高品質和早熟箭筈豌豆品種培育工作的逐步推進，我國箭筈豌豆DUS測試指南的研制已迫在眉睫。UPOV于2013年公布了箭筈豌豆DUS測試指南，共包括23個測試性狀，35個參照品種，可為我國箭筈豌豆DUS測試指南的研制提供參考依據[12]。

本研究團隊從2010年起，長期從事草類植物新品種DUS測試指南的研制工作，先后研制和頒布了《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 草地早熟禾》(NY/T2428-2013)[13]和《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 紫花苜蓿和雜花苜蓿》(NY/T2747-2015)[14]農業行業標準。相繼在2017-2018年，承擔了農業農村部下達的箭筈豌豆新品種DUS測試指南的研制項目，在指南研制過程中，以TG/1/3、TG/32/7等相關文件為技術指導[15-18]，并結合考慮我國箭筈豌豆育種水平和生產實際，在國內外廣泛收集箭筈豌豆品種進行了連續多年的DUS測試性狀的評價。項目已經完成了箭筈豌豆田間DUS性狀測定和參照品種篩選，以及室內的DAN指紋圖譜構建技術的研究[9]，為測試指南的研制積累了大量的測試數據和豐富的技術資料。本研究報道了箭筈豌豆新品種DUS測試指南研制的主要結果：測試性狀的評價和參照品種的確定。旨在為我國箭筈豌豆新品種 DUS 測試指南的制定提供技術依據，為促進我國箭筈豌豆品種的審定、登記和保護工作的健康發展而服務。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

研究樣地位于蘭州大學草地農業科技學院榆中北山定位研究站，屬于典型的半干旱黃土丘陵區，年降水量382 mm；年蒸發量1343 mm；年平均溫度6.7 ℃；海拔1720 m；無霜期90～140 d。

1.2 試驗品種

本試驗參試品種共51個，分別由美國國家種質資源庫、中國農業農村部全國畜牧總站、國家草種質資源庫和蘭州大學草地農業科技學院等單位提供(表1)。參試品種來自中國、前蘇聯、匈牙利、法國、美國等6個國家，我國的品種包括了已審定登記的主要品種13個：分別為蘭箭1號、蘭箭2號、蘭箭3號、蘇箭3號、蘇箭3號(淮陰)、蘇箭4號、蘇箭5號、中牧324、6625、324、333/A、定西和6625大莢。在51個品種中，其中部分品種的形態等性狀在課題組以往工作中也進行了研究[8,19]，為本試驗參試品種的確定奠定了基礎。

1.3 試驗設計

田間試驗采用完全隨機區組設計，行株距均為60 cm，每份參試品種3次重復，每重復70株箭筈豌豆，試驗田建植后按大田生產方式管理，及時處理病蟲害。田間試驗連續進行了兩年(2017-2018年)，每年4月25日左右播種，5-11月進行性狀觀測。

1.4 測定性狀、表達狀態和觀測方式

測試性狀共計31個，包括UPOV箭筈豌豆DUS測試指南中的全部性狀23個，以及以往研究認為有特異潛力的性狀8個。UPOV 23個性狀分別為：第二主葉長寬比、莖基部花青甙著色、葉片的綠色程度、初花期、莖上部節間絨毛、葉腋花青甙著色、葉片頂部形狀、葉片寬度、托葉蜜腺花青甙顏色、花色、莢果絨毛、莢果長度(不包括分化的莢果尖部)、莢果寬度、莢果分化尖的長度、胚珠數、種子重量、種子形狀、外種皮底色、種皮褐色形狀、種皮褐色面積、種皮藍黑色形狀、種皮藍黑色面積和子葉顏色；新增8個性狀分別為：葉面積、葉長寬比、莖粗、植株生長習性、分枝數、炸莢性、每植株莢果數和莢果顏色。

依據《測試指南的研制》(TG/7)和TG/32/7文件對每個性狀的表達狀態和測試方法進行了規定[15]。表達類型分為質量性狀(表達狀態不連續的性狀)、數量性狀(表達狀態覆蓋了從一個極端到另一個極端之間的整個變異范圍的性狀)和假質量性狀(表達范圍至少部分連續，但在一個以上方向/維度上存在變異的性狀)。在方法測試中質量性狀和假質量性狀的測定采用群體目測；數量性狀測定：利用游標卡尺、直尺、色度計和天平等進行測量，葉長、葉寬和葉面積使用平板掃描儀(EPSON GT-15000)掃描葉片，然后利用WinSEEDLETM2011圖像分析系統進行圖像處理。

1.5 數據處理

表1 參試51個箭筈豌豆品種的名稱和來源地Table 1 The information of 51 common vetch varieties in the experiment

2 結果與分析

2.1 UPOV箭筈豌豆DUS測試指南中的性狀測定及參照品種確定

2.1.1測試性狀的選擇與評價 《植物品種特異性、一致性、穩定性測試總論》指出用于DUS測試的性狀應滿足：1)是特定的基因型或者基因型組合作用的結果；2)在特定環境條件下是可重復的；3)在品種間表現出足夠的差異，可用于特異性判定；4)能夠被準確識別和描述；5)滿足一致性和穩定性的要求[20]。基于上述基本條件，對UPOV箭筈豌豆23個DUS 測試性狀進行了評價，其中包括：16個數量性狀、3個質量性狀和4個假質量性狀(表2)。

根據兩年田間的實測結果對上述部分性狀進行了補充和修改。TG/1/3文件指出形狀可作為假質量性狀，因此將葉片頂部形狀和種子形狀由數量性狀修改為質量性狀。性狀“外種皮底色”在白色、灰綠色、灰褐色和褐色的分級基礎上增加黃色和藍黑色的表達狀態；“種子形狀”的表達狀態由圓形、輕度不規則和極不規則的分級基礎上增加近方形和橢圓形(表2)。

表2 箭筈豌豆DUS測試性狀Table 2 The characteristics of common vetch DUS test

續表2 Continued Table 2

續表2 Continued Table 2

續表2 Continued Table 2

注：QL：質量性狀；QN：數量性狀；PQ：假質量性狀；MG：群體測量；MS：個體測量；VG：群體目測；A：樣本量為100個植株或100個植株的100個部位；B：樣本量為200株； *：標注性狀為UPOV用于統一品種描述所需要的重要性狀；序號1～23為UPOV 23個箭筈豌豆DUS測試性狀，序號24～31為8個新增性狀。

Note: QL: qualitative characteristic; QN: quantitative characteristic; PQ: pseudo-qualitative characteristic; MG: single measurement of a group of plants or parts of plants; MS: measurement of a number of individual plants or parts of plants; VG: visual assessment by a single observation of a group of plants or parts of plants; A: sample size of 100 plants/parts of plants; B: sample size of 200 plants; *: The test guidelines which are important for the international harmonization of variety descriptions and should always be examined for DUS； the numbering of 1-23 represent UPOV common vetch DUS test characteristics; and the numbering of 24-31 represent 8 new characteristics.

2.1.2參照品種的確定 本試驗共篩選出來自6個不同國家的32個箭筈豌豆參照品種，包括了我國已審定登記的品種11個：蘭箭1號、蘭箭2號、蘭箭3號、蘇箭3號、蘇箭3號(淮陰)、蘇箭4號、蘇箭5號、中牧324、6625、324和333/A；法國的4個品種：Blanchegrain、Carole、Caroline和Vedoc；前蘇聯的3個品種：Stanislavskaya、Tyesisskaya、Votkinskaya；美國的5個品種：Cahaba white、Nova II、Vanguard、Vantage、Warrior；匈牙利的7個品種：Bogorodnjikaja 800、Charkovszkaja n.134、Rugener、Kabylie 130、Kamalinszkaja a-611、Osztrak tajfajta、Plov div和Strzeleche rdzowa；以及敘利亞的1個品種Line 715。

2.2 箭筈豌豆新增性狀測定及參照品種確定

2.2.1測試性狀的選擇與評價 根據本課題組對收集到的箭筈豌豆種質資源形態等性狀的觀測，新增了8個能夠穩定遺傳、且具有特異性的觀測性狀，包括1個質量性狀(炸莢性)、6個數量性狀(葉面積、葉長寬比、莖粗、分枝數和每植株莢果數)和1個假質量性狀(莢果顏色)。對新增性狀的觀測時期、方法、樣本量和表達狀態進行了評價和描述(表3)。觀測時期分布在現蕾期到完熟期之間，現蕾期指標包括：葉面積、葉長寬比、莖粗和生長習性；莢果發育期包括：分枝數；50%的莢果成熟、種子呈現固有色澤、變硬到完熟期包括：每植株莢果數和莢果顏色；完熟期包括炸莢性，觀測時期的劃分詳見表3。觀測方式包括3個群體目測指標：生長習性、炸莢性和莢果顏色；5個群體目測或個體測量指標：葉面積、葉片長寬比、莖粗、分枝數和每植株莢果數。新增性狀的觀測樣本量均為200個植株。

2.2.2參照品種的確定 本試驗為新增的8個DUS測試性狀共篩選出21個參照品種，包括國內品種8個：蘭箭1號、蘭箭2號、蘇箭3號(淮陰) 、蘇箭4號、蘇箭5號、中牧324、324、6625；國外品種12個：Blanchegrain、Cahaba white、Carole、Kabylie 130、Line 715、Rugener、Strzeleche rdzowa、Tyesisskaya、Vanguard、Vantage、Vedoc和Warrior。上述參照品種均包含在UPOV箭筈豌豆DUS測試性狀中確定的32個參照品種中。

2.3 箭筈豌豆生育階段

本試驗涉及的箭筈豌豆DUS測試性狀分布于植株、莖、葉、花、莢果和種子等部位，不同部位的性狀觀測往往需要特定的時期，降低由于觀測時期不同帶來的差異，以保證獲得最佳的判定結果。表3為箭筈豌豆31個性狀所對應的全部觀測時期，主要包括葉發育期、現蕾期、開花期、莢果發育期(綠熟期)、莢果和種子成熟期5個時期。

表3 箭筈豌豆生育階段Table 3 Phenological growth stages of common vetch

2.4 分組性狀的確定

使用分組性狀可以將已知品種分組種植，從而選擇出近似品種，而近似品種的臨近種植則有助于不同品種間的特異性判定。依據TG/1/3測試總則4.8“性狀的功能性分類”和UPOV箭筈豌豆DUS測試指南，對箭筈豌豆DUS測試性狀可采用下列6個性狀進行品種分組：a)開花時間；b)托葉：蜜腺花青甙顏色；c)種子：種皮底色；d)種子：種皮褐色形狀；e)種子：藍黑色斑紋；f)種子：子葉顏色。例如：測試品種植株種皮褐色形狀為“點狀”和子葉的顏色為“灰褐色”, 在田間種植時可以把種皮褐色形狀為 “無”、“斑狀”、“點狀和斑狀”，且子葉的顏色為“橘黃色”的已知品種排除。

2.5 箭筈豌豆品種 DUS 判定標準

根據UPOV公約(1961/1972、1978和1991文件)，一個品種必須與其他已知品種有明顯區別才能滿足特異性要求，而且差異必須具有穩定性。箭筈豌豆 DUS 的判定標準如下:

2.5.1特異性判定 特異性測試是DUS測試的核心，如果兩個品種性狀間的差異方向一致，而且差異是明顯的，則認為這兩個品種是可明確區分的。如果測試品種間差異非常顯著，只需安排1個生長周期的種植試驗，如環境因素等的影響導致品種間差異不顯著，則需要至少2個生長周期的觀測。明顯的差異是指兩個品種間性狀表達的差異能夠明顯觀測到或通過統計分析方法判定差異顯著(排除環境變異的影響)。判斷兩個品種之間的差異是否明顯取決于多種因素，尤其是性狀的表達類型，即該性狀是質量性狀、數量性狀還是假質量性狀。

箭筈豌豆特異性測試的觀測數量應滿足在20個植株或20個植株的20個部位。兩個品種的質量性狀只要存在1個顯著差異的性狀，兩個品種間即具備特異性。例如，質量性狀“種子子葉顏色”(性狀23)的表達狀態可分為“灰褐色”和“橘黃色”(圖1)。若測試品種和近似品種該性狀上分屬于不同的表達狀態，可判定這2個品種間存在顯著差異，具有特異性。

數量性狀應滿足兩個品種間有1個性狀≥2個代碼的差異，或是2個以上性狀具有顯著差異，可判定測試品種間具備特異性。 例如，數量性狀“幼苗第二主葉的長寬比”，表達狀態分為“極低”、“低”、“中”、“高”、“極高”，分級代碼為“1、3、5、7、9”，“Osztrak tajfajta”品種分級為“3”，“蘭箭3號”品種分級為“7”，則可明確判定兩個品種間具有特異性(圖2)。當只有一個代碼差異時，兩個品種可能非常接近代碼的臨界值(如代碼5的高端和代碼6的低端)，則需利用測量值進一步比較兩個品種是否具有明顯差異，因為有時小于兩個代碼的差異也可能具有明顯的差異。

圖1 箭筈豌豆種子子葉顏色的表達狀態分級Fig.1 The expression state of color of cotyledons in common vetch

圖2 箭筈豌豆第二主葉長寬比的表達狀態分級及對應的參照品種Fig.2 The expression state of the ratio length/width of second primary leaf and corresponded reference varieties in common vetch

假質量性狀是部分連續的，在整個尺度上分布并不均勻，而且變異范圍是多維的，很難確定出判定特異性所需要的代碼差異。如：“種子種皮藍黑色形狀”(性狀19)的類型為：無(代碼1)；點狀(2)；斑狀(3)；點狀和斑狀(4)(圖3A)，雖然代碼分別為1和2的品種間的代碼差別為1，1和4的品種間的代碼差別為3，但不宜說后者比前者的差異明顯。“花色”(性狀10)的類型為：白色(代碼1)；粉紅色(2)；淺紫羅蘭色(3)；中等紫羅蘭色(4)；深紫羅蘭色(5)，表達狀態1和2(1個代碼差異)的品種比表達狀態為2和5(3個代碼差異)的品種差異更大(圖3B)。

圖3 箭筈豌豆(A)種子藍黑色形狀和(B)花色的表達狀態分級Fig.3 The expression state of (A) seed blue-black ornamentation and (B) color of standard flower in common vetch

2.5.2一致性判定 箭筈豌豆一致性判定的樣本量分為：A樣本量為100個植株或100個植株的100個部位；B樣本量為200個植株。箭筈豌豆為自花授粉植物，品種內變異很小，變異主要來自于環境條件的影響，通常采用“異型株法”判定，用1%總體標準和 95%接收概率來確定異型株的數量。在樣本量為200個植株的情況下，異型株的最大允許值為5，樣本量大小為100個植株或100個植株部位情況下，最大允許值為3個異型株。對于“A” 樣本量，先觀測20個植株或20個植株的部位，如果沒有發現異型株，表明該品種符合一致性。如果異型株>3個，則表明品種不一致。如果觀測到1～3個異型株，則必須觀測到80個植株或80個植株的部位。

2.5.3穩定性 在實際操作中，通常不單獨進行穩定性測試，如果一個品種具備一致性，認為該品種具備穩定性。如特殊情況或存在疑問時，可通過種植該品種的下一代種子，與以前提供的繁殖材料相比，若性狀表達無明顯變化，則可判定該品種具備穩定性。

3 討論

截止2019年4月，UPOV和歐盟植物品種局(Community Plant Variety Office, CPVO)已分別為325和192個植物屬和種制定了DUS測試指南，DUS測試指南的公布數量整體呈現不斷增加的趨勢(圖4)。同期，我國已公布了189項DUS測試指南，其中包括4個豆科牧草的DUS測試指南，分別為苜蓿(Medicagosativa；NY/T 2747-2015)[13]、柱花草屬(Stylosanthes；NY/T 3434-2019)[21]、白三葉(Trifoliumrepens；NY/T 2565-2014)[22]和紅三葉(Trifoliumpretense；NY/T 2480-2013)[23]，其中苜蓿共有21個基本性狀和4個選測性狀；柱花草有24個基本性狀和3個選測性狀；白三葉有31個基本性狀；紅三葉有30個基本性狀。以上物種均為多年生豆科牧草，其中部分性狀的觀測在播種當年觀測，部分在建植第二年進行觀測。除柱花草外，剩余3種豆科牧草為異花授粉植物，在種群內具有更大的變異水平。本研究共評價了31個測試性狀，箭筈豌豆作為一年生自花授粉豆科牧草，由于長期高度自交繁殖，個體基因型純合度高，所有性狀的觀測結果均可在一個完整的生長周期中獲得，而且相較上述多年生豆科牧草具有更多的觀測性狀。苜蓿、柱花草、白三葉和紅三葉的DUS測試性狀主要集中于營養器官(葉片等)，而在箭筈豌豆的31個測試性狀中，有8個性狀與種子相關，表明箭筈豌豆種子在不同品種間具有更豐富的遺傳多樣性。在苜蓿和柱花草的選測性狀中涉及了抗性(抗病性和抗逆性)指標，箭筈豌豆被認為是一種抗寒作物，可以在冬季溫和的地區生長[24]，因此在后續的研究中應考慮增加耐寒、耐鹽、耐旱和抗炭疽病等選測性狀。

圖4 UPOV和CPVO不同年份DUS測試指南公布數量統計(數據整理自UPOV和CPVO官網)Fig.4 The number of DUS test guidelines developed by UPOV and CPVO (The data obtained from the official website of the UPOV and CPVO)

UPOV箭筈豌豆DUS測試性狀中，部分性狀的表達狀態未能找到對應的參照品種，此外，部分性狀的表達狀態不能夠將本研究收集的箭筈豌豆品種的性狀準確描述。本研究對UPOV箭筈豌豆的23個測試性狀有新的補充和修訂，同時新增了8個具有DUS測試潛力的性狀，并為31性狀的所對應的表達狀態找到了參照品種。此外，在31個測試性狀中，22個性狀是受環境因素影響較大的、多基因控制的數量性狀。因此在測試箭筈豌豆品種時，在栽培管理上需要嚴格控制環境條件。同時測試人員的實測經驗也很重要，因此測試人員需要經過專業培訓，以保證對測試性狀做出準確判定。隨著箭筈豌豆品種選育工作的進一步開展，可能需要對本研究結果做進一步的修訂，所以在實際測試中不局限本研究中篩選確定的性狀和參照品種。如果測試品種與參照品種間存在特異性，但是性狀表中的性狀又不包含這些性狀，可根據UPOV TG/1/3文件對“未列出性狀”的要求增加性狀描述，以滿足箭筈豌豆DUS測試的需求。

4 結論

為了能夠與UPOV接軌并達到國際水平，本試驗主要以TG/32/7、TG/1/3及其相關系列文件為總體原則，同時結合我國箭筈豌豆育種現狀和前期研究的基礎上，對我國箭筈豌豆DUS測試的核心內容進行研究，共確定了32個參照品種和31個DUS測試性狀，并對UPOV箭筈豌豆DUS測試指南中的部分性狀表達狀態的分級進行了補充。可為我國箭筈豌豆新品種 DUS 測試指南的形成提供基礎，進而加速我國箭筈豌豆品種的保護、審定、登記和育種進程。