基于HAND系統5種致腹瀉大腸桿菌多重實時PCR初篩方法的建立

鐘宜科 王永霞 趙 彤 賀曉明郭建樹 劉 威 鄒大陽

(1. 河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056038； 2. 中國人民解放軍疾病預防控制中心，北京 100000)

近20年，食源性疾病的發病率明顯增加，已成為全球主要的公共問題之一[1]，而腹瀉病占全球食源性疾病50%以上[2]。大腸桿菌為主要致病性細菌之一[3]，根據致病機制及臨床表現，常見的致腹瀉大腸桿菌有5類：腸致病性大腸桿菌(EnteropathogenicE.coli，EPEC)、腸產毒性大腸桿菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EnteroinvasiveE.coli，EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicE.coli， EHEC)和腸黏附性大腸桿菌(EnteroaggregativeE.coli， EAEC)[4]。

傳統的病菌檢測方法操作復雜、耗時長；免疫學檢測方法靈敏性不足，易造成假陰性。由于多重實時SYBR Green PCR由多種不同引物混合，很難克服多種引物間的相互干擾及引物二聚體的形成，使得反應體系擴增效率不均衡，穩定性差，造成結果不準確。而HAND系統，即相同標簽輔助無引物二聚體系統(Homo-Tag Assisted Non-Dimer System，HANDS)[5]，是為了消除和減少引物二聚體的產生而設計的試驗方法，以此提高檢測結果的特異性[6]。

試驗擬通過HAND系統設計一種同源加尾引物在一管內能夠同時檢測5種大腸桿菌，可有效減少反應中二聚體及非特異性擴增的出現，且檢測結果準確性高的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 引物

詳見表1、2。

1.1.2 試劑

乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

引物：生工生物工程(上海)股份有限公司；

預混SuperReal PreMix Plus(2×)、雙蒸水、瓊脂糖、D2000 DNA Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒和糞便基因組DNA提取試劑盒購：天根生化科技(北京)有限公司；

10 000× Gelred：美國Biotium公司；

表1 普通引物

表2 加尾引物及多重實時PCR溶解曲線Tm值?

? F. 正向引物；R. 反向引物。

10×loading buffer：寶日醫生物技術(北京)有限公司；

營養肉湯(NB)、營養瓊脂(NA)：北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.3 儀器與設備

熒光定量PCR儀：CFX384型，美國伯樂公司；

凝膠成像：GelDoc XR Biorad型，美國伯樂公司；

熒光計：Invitroge Qubit 3型，美國賽默飛世爾科技公司；

生物安全柜：1300系列Ⅱ級A2型，美國賽默飛世爾科技公司；

小型臺式離心機：5424型，德國Eppendorf公司；

渦旋振蕩器：VORTEX-5型，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養 將甘油保存的菌株，劃線于NA培養基上，37 ℃過夜培養，然后挑取單菌落，接種于5 mL NB培養基中，37 ℃，180 r/min，過夜培養。

1.2.2 DNA模板制備 取1.2.1細菌培養液2 mL，離心取沉淀；向菌體沉淀中分別加入200 μL GA、20 μL ProteinaseK、220 μL GB，振蕩，70 ℃放置10 min；加220 μL無水乙醇振蕩混勻；將細菌培養液離心所得溶液及絮狀沉淀加入吸附柱中，離心，倒掉廢液；向吸附柱中加入500 μL GD，離心，倒掉廢液；向吸附柱中加入600 μL PW，離心，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中；將吸附柱置于室溫放置數分鐘；將吸附柱CB3轉入干凈離心管中，向吸附膜滴加100 μL TE，離心，將溶液收集到離心管中，利用Invitrogen Qubit 3熒光計進行濃度測定，然后稀釋凍存備用。

1.2.3 單重實時PCR的建立 最終反應體系和反應程序：單重實時PCR反應體系(20 μL)為2×SYBR Green Mix 10 μL，尾巴引物(10 μmol/L)2 μL、上下游加尾引物(10 μmol/L)各0.1 μL，模板2 μL，雙蒸水補足至20 μL；PCR循環參數為95 ℃預變性10 min后；95 ℃ 10 s、58 ℃ 1 min進行35個循環；溶解曲線溫度65～95 ℃，間隔0.5 ℃，每5 s讀數。

1.2.4 多重實時PCR建立 反應體系見表3，為了證明加尾系統能有效減少二聚體和非特異性擴增，同時利用普通引物進行擴增，反應體系見表4，兩種擴增程序同1.2.3，瓊脂糖凝膠電泳對比擴增產物。考慮到實際疫情爆發時，樣本中通常只有一種病原，而同一反應體系中出現多種擴增靶序列時，溶解曲線表現為多個連續的波峰，不利于結果判斷，故每種反應體系只加入一種菌株DNA模板。

表3 加尾引物反應體系

表4 普通引物反應體系

1.2.5 多重PCR的特異性 對實驗室保存的17株種屬關系較近的菌進行檢測，DNA提取同1.2.2，PCR體系同1.2.4，PCR反應程序同1.2.3，生成擴增曲線及溶解曲線，評價其特異性。

1.2.6 多重實時PCR的重復性、穩定性 每株菌進行10次重復，對結果進行統計學分析，計算Ct值的標準偏差(SD)及變異系數(CV)[11]。

1.2.7 糞便模擬樣本檢測

(1) 菌株的培養：將甘油保存的菌株，劃線于營養肉湯瓊脂培養基上，37 ℃過夜培養，然后挑取單菌落，接種于5 mL營養肉湯培養基中，37 ℃，180 r/mim，過夜培養。用生理鹽水調至麥氏濁度為1(菌濃度約為3×108CFU/mL)[12]，然后進行10倍稀釋，使其終濃度為3×103CFU/mL。

(2) 糞便處理：取3 g健康人糞便于30 mL PBS中，混勻備用。

(3) 糞便模擬標本：將1.2.7(1)的菌液與1.2.7(2)的糞便溶液按1∶1(體積比)進行混勻，備用。

(4) 樣本檢測：用DNA提取試劑盒進行糞便模擬標本DNA提取，用1.2.5中多重熒光定量PCR反應體系及反應程序進行模擬標本的檢測。

1.3 數據處理

運用Excel 2010對試驗數據進行分析，所有數據以(x±SD)形式表示。

2 結果與分析

2.1 加尾引物單重熒光PCR的建立

由圖1可知，擴增產物目的條帶單一，與預期大小一致；熒光曲線圖呈現典型的“S”型曲線，溶解曲線單一峰，無非特異擴增。

2.2 多重實時PCR的建立

2.2.1 普通引物 由圖2(a)可知，普通引物具有良好擴增效率；圖2(b)中EAEC(aggR)、EHEC(eae)及ETEC(LT)溶解曲線峰不單一、陰性對照出現假陽性；圖2(c)中A、D泳道出現兩條帶，其中一條為目的片段，另一條為100 bp左右的非目的片段；上述結果均表明普通引物產生了非特異性擴增。

2.2.2 加尾引物 由圖3可知，加尾引物具有良好的擴增效率，4對引物溶解曲線具有單一溶解峰，陰性對照無非特異性擴增和二聚體的產生，瓊脂糖凝膠電泳進一步證實了加尾引物可有效減少二聚體。

對比圖2、3可知，在多重熒光定量PCR體系中，加尾引物的特異性高于普通引物。

2.3 多重實時PCR的特異性

由表5可知，1株EPEC、2株EHEC、1株EIEC、1株ETEC、1株EAEC及1株志賀氏菌呈現陽性結果，其余均為陰性。

M. 2 000 bp Marker A. EAEC(aggR) B. EHEC(eae) C. EPEC(eae) D. ETEC(LT) E. EIEC(ipaH) F. 陰性對照

M. 2 000 bp Marker A. EAEC(aggR) B. EHEC(eae) C. EPEC(eae) D. ETEC(LT) E. EIEC(ipaH) F. 陰性對照

M. 2 000 bp Marker A. EAEC(aggR) B. EHEC(eae) C. EPEC(eae) D. ETEC(LT) E. EIEC(ipaH) F. 陰性對照

Duttas等[13]研究表明，eae引物既能擴增EHEC也能擴增EPEC。志賀氏菌與EIEC具有類似的基因組特征和臨床表現，研究[13]發現幾乎所有引物未能區分志賀氏菌與腸侵襲性大腸桿菌。ipaH引物為EIEC與志賀氏菌群所共有引物，試驗中針對EIEC的ipaH引物也能擴增志賀氏菌，在實際檢測中可能無法區分這兩種細菌。

2.4 多重實時PCR的重復性、穩定性

由圖4可知，每種大腸桿菌擴增曲線與溶解曲線基本一致，而表6中，5種大腸桿菌Ct<5%，表明其具有良好的重復性與穩定性。

2.5 糞便模擬樣本檢測

由圖5可知，EAEC、EHEC、EPEC、ETEC、EIEC檢測靈敏度分別為105，105，106，104，105CFU/mL，試驗建立的多重PCR敏感性為105CFU/mL左右。由于體系中有多條引物存在，可能影響試驗的敏感性，而模擬樣本較復雜，含有糞便中的各種DNA模板。而在腹瀉糞便樣本中往往需進一步增菌培養，菌液濃度遠高于試驗方法檢測的最低限，對檢測結果無影響。此外試驗方法檢測的特異性不受復雜樣本影響，可保證結果的正確性。

表5 多重實時PCR菌株的測定?

? “—”為陰性結果；“+”為陽性結果。

A. EAEC(aggR)；B. EHEC(eae)；C. EPEC(eae)；D. ETEC(LT)；E. EIEC(ipaH)；F. 陰性對照

圖4 5種大腸桿菌多重實時PCR重復性擴增曲線

Figure 4 Reproducible amplification curves and dissolution curves of muiplex real-time PCR for five kinds ofEscherichiacoli

圖5 5種大腸桿菌模擬樣本敏感性

菌株CtCV/%菌株CtCV/%EAEC10.558±0.196 0512ETEC10.791±0.198 5672EHEC15.492±0.224 4911EIEC8.406±0.149 9472EPEC16.533±0.424 3363

3 結論

將HAND系統與多重實時PCR結合，建立了一種在單管內能同時檢測5種致瀉性大腸桿菌的快速檢測方法，敏感性為104～106CFU/mL。相比于常規多重實時PCR檢測，該方法明顯降低了非特異性擴增，具有更高的特異性。試驗克服了核酸檢測中特異性的問題，避免了假陽性的產生，提高了檢測的準確性，滿足對致瀉性大腸桿菌的初步篩選。但試驗方法的敏感性較低，后續可通過增加檢測循環數和篩選更優引物以提高檢測限。