常見豬病診斷中口腔液樣品采集及注意事項

陳善真葉 平王貴平 饒 雷賓 梅馮彥君 林顯站陳海輝曹仁祺*

（1廣東海大畜牧獸醫研究院，廣東廣州 511400；2桂林聯勤保障中心第二儲備資產管理局，廣西桂林 541000；3陽西縣豐沃生態農業有限公司，廣東陽江 529800）

口腔液具體指唾液、齒齦分泌物、口腔部創傷分泌物、食物和水的混合物等，其中包括上皮細胞和黏膜細胞、微生物、酶、其他生物活性分子。采集口腔液具有無創、省力、快速、應激少、避免公豬傷害、費用低、無需訓練采樣技巧、擴大采集樣本數量等優勢[1]。在人醫上采集口腔液已經用于診斷口腔疾病和消化系統性疾病，目前已經從人的口腔液中鑒定出23種病毒和14種病原菌與全身感染性疾病有關，這些病毒包括皰疹病毒、肝炎病毒、HIV等[2]。

在獸醫領域，前蘇聯最早將馬的口腔液用于疾病監測。在豬病方面，1976年Corthier首先將豬的口腔液用于豬瘟的檢測，對于豬的常見疾病，如非洲豬瘟（ASF）、豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）、豬圓環病毒2型病、流感病毒（IVA）感染、輸血傳播病毒（TTV1/2）感染、大腸桿菌病、鏈球菌病、豬肺炎支原體病等都可以通過口腔液做抗原或抗體檢測。此外，豬口腔液還可以用于早期診斷，一些傳染病的病毒性血癥在出現癥狀前，已經存在于口腔液中，因此將口腔液用于診斷動物的疾病可以比血清樣品更早得到結果。

對每欄豬只采集口腔液是傳統的采血和采集病料的替代方案，尤其在豬群藍耳病的抗原和抗體檢測和監測中應用較多。Prickett等[3]發現豬口腔液和血液中的PRRSV抗原檢測一致性為77%；Graage等[4]通過對口腔液和血清的藍耳病病毒抗體檢測比較，也發現其一致性較高。此外，除了在豬群口腔液中可以做抗原檢測，也可以對單頭豬只的口腔液做抗體抗原檢測。Kittawornrat等[5]在單個公豬試驗采樣中發現，口腔液相對于血清在檢測個體公豬PRRSV中更有優勢，認為其可以取代血清檢測。本文通過采集豬群口腔液對一些病毒的抗原進行檢測，旨在為后期豬病的診斷提供更多思路。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

不同規格棉繩、剪刀、大自封袋、50mLEP管。

1.2 試驗方法

豬口腔液采集的主要目的是讓盡量多的豬在短時間內盡可能多地咀嚼棉繩。觀察豬在1 min內咀嚼棉繩的次數，一般1頭豬咀嚼棉繩的時間超過20 s可認為是豬—繩相互作用1次。

口腔液采集流程如下：

①將全棉繩吊系于豬舍的豬欄上，保育豬舍的棉繩以直徑1.3 cm為宜，育肥豬或生產公母豬豬舍的棉繩直徑以1.6 cm為宜；不同的飼養密度，懸掛的棉繩數量不同，如果一欄飼養豬只數量較少，可以懸掛較少的棉繩，如果一欄飼養豬只數量較多，可以懸掛較多的棉繩，以確保欄內的每頭豬只都能咀嚼到棉繩，保證采集足夠的口腔液（圖1）；

②棉繩懸掛在遠離食槽和排便的區域，上端固定，下垂高度與豬只的肩關節齊平，約70 cm高；

③吸引豬只咀嚼，30 min后收取棉繩；

④刮取和擠壓棉繩上的口腔液至1 L裝的自封袋內，然后再將液體裝入50 mL EP管，一般認為大于1 mL口腔液即為有效采集量。

2 影響口腔液采集的因素

2.1 豬群年齡

豬具有群體模仿探究一致性行為。對于肉豬來講，年齡越大的豬探究行為越強，但妊娠母豬和公豬對棉繩好奇心較差。試驗表明，12～14周齡的豬在試驗開始15 min后咀嚼棉繩比例明顯增加[6]。

2.2 豬群規模

在30 min內，各年齡段豬只咀嚼比例平均為78.5%。豬群規模越大，咀嚼比例越低，其中存欄16～20頭豬的欄舍其豬只咀嚼棉繩的比例高于存欄20～26頭的欄舍和存欄26頭以上的欄舍[7]。

2.3 母豬限位欄

限位欄內母豬平均咀嚼棉繩的時間為2 min 42 s，咀嚼棉繩時間大于2 min的影響因素主要包括稻草鋪的地板、大的棉拭子（270 cm2）和操作者[8]。

2.4 咀嚼時間

絕大多數的豬咀嚼時間超過20 s，加上前述78.5%的咀嚼比例，可以認為采集的唾液樣品代表了此欄豬的感染狀態[9]。

2.5 咀嚼次數

絕大多數的豬咀嚼次數超過1次。

2.6 是否采食

在飼喂前采集豬的唾液樣品，豬由于好奇心，相對于采食后，咀嚼比例要高。

2.7 棉繩數量

每欄懸掛多于1條棉繩比1條棉繩咀嚼比例會增高。

3 討論

3.1 有部分豬不咀嚼棉繩

圖1 不同密度豬群采樣繩的懸掛

在豬群中，有些豬不會咀嚼棉繩，即使在棉繩上噴灑葡萄糖也無濟于事，其原因有待分析。在對群養母豬采樣時發現，絕大多數欄，有大于40%的母豬咀嚼棉繩，最少的欄也有10%母豬咀嚼棉繩。有學者用群體采樣和單獨采樣法采集口腔液樣品與采集的血樣樣品進行PRRSV的抗體比較試驗，發現單獨口腔液采樣特異性低于血樣，但5個口腔液混樣后可提高其抗體特異性。

3.2 采樣棉繩的準備

國外具有現成的棉繩樣品（St.Josef產品）或者棉拭子或Geno tube（Thermo fisher產品），目前國內杭州貝爾塔獸醫診斷實驗室有成套唾液采集樣品，或是網購。網購棉繩時盡量不選擇有染料棉繩，此類棉繩會添加染料，染料會對后續熒光定量PCR反應產生干擾，甚至會出現假陽性結果。棉拭子可以采用人醫用的一次性滅菌棉拭子。

3.3 其他采樣方式的特點

部分疾病如ASF也可以用鼻拭子、口腔拭子、肛拭子和口腔液檢測，鼻拭子采樣時因為操作無法確實，結果有時會受影響。口腔液檢測因為受多種唾液酶的影響，樣品采好后，需立刻冷藏保存運輸，且在樣品到達實驗室后應立即檢測，避免當一些病毒的核酸含量低時，核酸分解而出現假陰性結果。以上何種檢測方法更敏感或更適合于疫病的早期診斷，還需要進一步研究。

3.4 口腔液采集時的注意事項

①棉繩極具吸水能力，口腔液采集后需要及時將唾液擠出，否則時間過久，口腔液將無法擠出。②采集口腔液時，當欄位數較多時，注意樣品間的交叉污染，同時注意標記好每欄編號，以便回溯檢查。③口腔液因為其中抗原或抗體含量較少，為避免其降解，需在采樣后盡快放置在冰箱，且采樣后要求24 h內送達實驗室，并在實驗室及時檢測。

4 小結

綜上所述，口腔液樣品的采集過程非常重要，僅當有高質量的樣品時，才會產生合格的檢測結果。隨著口腔液中病原DNA提取技術的改善和口腔液DNA檢測方法的進一步完善，口腔液在豬病檢測上的用途會越來越廣泛。