竹蓀多糖與多西紫杉醇聯用抗肺癌效應及機制研究

王小紅 江洪 丁藝暉 羅聰

肺癌在我國居民惡性腫瘤發病率中居于首位[1]，研究抗肺癌的新療法具有重要意義。多西紫杉醇（docetaxel，DOC）具有較好的抗肺癌效果，常作為二線化療藥物用于非小細胞肺癌（NSCLC）的單藥[2]和聯合治療[3-4]，其抗癌機制主要是阻滯細胞周期，從而誘導癌細胞發生細胞凋亡。但是單一藥物化療會產生耐藥性，即使初期癌細胞迅速被殺滅，腫瘤體積明顯縮小，多次反復使用后癌細胞由于基因突變而產生化療抵抗（耐藥性），是腫瘤復發和預后不佳的主要原因。化療藥物的靶點是腫瘤細胞，但腫瘤細胞周圍的微環境也參與化療抵抗的形成，特別是髓源抑制性細胞（MDSC）參與腫瘤微環境中免疫負調控的形成[5]。腫瘤細胞還會分泌CXCL-5主動招募MDSC進入腫瘤微環境，MDSC會分泌IL-23參與化療抵抗[6]，基于這一機制，靶向MDSC的臨床應用正成為惡性腫瘤治療的新策略[7-8]。竹蓀多糖具有誘導肺癌細胞[9]和骨肉瘤細胞[10]發生凋亡的效應，竹蓀多糖組分也有調節腫瘤微環境的效應[11]。本研究聯合應用竹蓀多糖組分ZSP1與DOC以期降低化療抵抗，提高肺癌的治療效果，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 化學試劑和儀器 竹蓀粗多糖購自杭州眾芝康菇公司，ZSP1由本實驗室自行制備；DOC（批號：180406AF，規格：每支20mg/0.5ml）購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；流式抗體（FITC-CD11b、APC-Gr1）均購自美國 BD公司；Western blot抗體（Anti-IL12、Anti-茁-actin）均購自美國Cell Signaling Technology公司；合成引物購自北京中美泰和公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司，PrimeScript RT Master Mix購自日本 TaKaRa公司；SYBR Green域Mix購自美國Thermo Fisher公司。流式細胞儀（FACSCalibur）購自美國BD公司；Western blot檢測顯色成像儀購自美國Bio-Rad公司。檢測步驟嚴格參照說明書進行。

1.2 實驗動物與分組、建模和治療 C57小鼠40只，鼠齡6～8周，體重18～22g；均購自北京維通利華公司。按照隨機數字表法分為對照組（應用0.9%氯化鈉注射液）、ZSP1組、DOC組和ZSP1+DOC（聯用組），每組10只，皮下注射路易斯肺癌（LLC）腫瘤細胞懸液100滋l（含腫瘤細胞5伊105個），當天即開始藥物干預，ZSP1組小鼠腹腔注射ZSP1 10mg/kg，DOC組小鼠腹腔注射DOC2mg/kg，聯用組腹腔注射相同劑量竹蓀多糖組分ZSP1和DOC，上述藥物均溶于100滋l的0.9%氯化鈉注射液，對照組注射100滋l的0.9%氯化鈉注射液，均隔日1次，開始治療第10、12、15天記錄腫瘤體積。另再選取Toll樣受體4（TLR4）基因敲除的C57小鼠（TLR4KO組）和野生型C57小鼠（WT組）各10只，鼠齡6～8周，體重18～22g；均購自北京維通利華公司進行抗腫瘤體內實驗。該兩組小鼠均用竹蓀多糖組分ZSP1和DOC混合液灌胃（劑量和配置方法同上述聯用組），1次/d，自第1天至第15天，并于第10、12、15天記錄腫瘤體積。

1.3 MDSC占外周血單核細胞比例的檢測 采用流式細胞術。實驗第10、12和15天鼠尾靜脈采血，肝素抗凝，用紅細胞裂解液裂解紅細胞后進行FITC-CD11b和APC-Gr1流式抗體染色，然后上流式細胞儀檢測。

1.4 MDSC 中 IFN-酌、IL-12、CXCL-9和 CXCL-2 mR原NA測定 采用實時熒光定量PCR法。動物實驗于第15天結束后麻醉處死小鼠，取出脾臟，將脾臟置于兩片滅菌玻片毛面間輕輕摩擦，制成細胞懸液，經流式細胞儀分選其中的MDSC，加入適量的Trizol液，提取RNA，采用PrimeScript RT Master Mix合成cDNA。采用SYBR Green域Mix試劑盒進行定量PCR分析，反應體系為15滋l，包括：cDNA 1滋g，上下游引物各 0.5滋l，SYBR Green域Mix 7.5滋l，水補足，檢測細胞因子 IFN-酌、IL-12、CX原CL-9和CXCL-2 mRNA水平變化。擴增條件：95益預變性1min，按以下條件擴增 40個循環：95益 15s，57益1min。引物序列見表1。

表1 IFN-γ、IL-12、CXCL-9和CXCL-2的引物序列

1.5 MDSC中IL-12蛋白表達水平測定 采用Western blot法。收集脾臟MDSC細胞，加入適量的組織裂解液，冰上裂解30min，4益，14 800r/min離心30min，取上清液，經蛋白定量后，取30滋g總蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離；經電轉膜后，用3%牛血清白蛋白室溫封閉90min，加入一抗，4益孵育過夜；PBST緩沖液洗滌，每次5min，共5次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1h，PBST緩沖液洗膜，每次5min，共5次，用增強化學發光試劑顯影，以茁-actin為內參。上述實驗重復3次。

1.6 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物聯用與單獨應用4組小鼠腫瘤體積的比較ZSP1組、DOC組和聯用組小鼠的腫瘤體積在第10、12、15天比對照組明顯縮小，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表 2。

表2 藥物聯用與單獨應用4組小鼠腫瘤體積的比較（mm3）

2.2 TLR4KO組與WT組小鼠腫瘤體積的比較 TLR4KO組小鼠的腫瘤體積在第10、12天較WT組明顯縮小（均P＜0.01），而在第15天，兩組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表 3。

表3 TLR4KO組與WT組小鼠腫瘤體積的比較（mm3）

2.3 藥物聯用與單獨應用4組小鼠MDSC占外周血單核細胞比例的比較 流式細胞術檢測結果顯示，第12、15天聯用組小鼠的MDSC比例均明顯低于對照組、ZSP1組和DOC組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖1和表4。

圖1 藥物聯用與單獨應用4組小鼠不同時間流式細胞術檢測結果

2.4 TLR4KO 組與 WT 組小鼠 IFN-酌、IL-12、CXCL-9、CXCL-2 mRNA表達水平和IL-12蛋白表達水平比較與WT組相比，TLR4KO組IFN-酌、IL-12和CXCL9mRNA表達水平均明顯增加（均P＜0.01），而CXCL-2mRNA表達水平未見差異（P＞0.05），見表5。IL-12蛋白表達水平有所增加，見圖2。

3 討論

以往的研究發現竹蓀多糖可以降低荷瘤小鼠脾臟中MDSC占脾臟細胞的比例，而MDSC是腫瘤微環境中主要的免疫負調控細胞之一，MDSC減少有助于解除對T細胞的免疫抑制效應，從而發揮機體自身的抗腫瘤免疫作用，促進腫瘤體積變小。

表4 藥物聯用與單獨應用4組小鼠MDSC占外周血單核細胞比例的比較（%）

表5 TLR4KO組與WT組小鼠IFN-γ、IL-12、CXCL-9和CXCL-2 mRNA表達水平比較

圖2 TLR4KO組與WT組小鼠IL-12蛋白表達的電泳圖

DOC作為肺癌臨床治療的二線藥物，常用于一線化療藥抵抗時的候選用藥。有研究表明，化療起效與免疫系統密切相關，化療是通過免疫系統中的CD4+和CD8+T細胞來發揮抗腫瘤療效，且其與非腫瘤細胞表達IFN-酌受體有關[12]。T細胞分泌IFN-酌，作用于腫瘤相關成纖維細胞（CAF）表面的IFN-酌受體后，CAF分泌的血管內皮生長因子減少，導致血管新生減少[13-14]，引起腫瘤缺血性壞死。也有學者認為是由于IFN-酌直接作用于血管內皮細胞[15]，導致其凋亡，從而阻斷腫瘤內的血管新生。

化療可誘導腫瘤細胞發生免疫原性細胞死亡（im原munogenic cell death，ICD）[16]。某些化療藥（蒽環類及鉑類）誘導ICD后，引起機體產生腫瘤特異性免疫反應，從而導致腫瘤體積縮小，該效應與TLR4受體有關。有研究采用光治療與免疫佐劑糖化殼聚糖聯用，利用光治療產生的ICD效應，通過免疫佐劑的刺激效應，進一步激活機體的腫瘤特異性免疫反應，在胰腺癌治療中取得了一定的效果[17]。

本研究將化療藥物與免疫調節劑竹蓀多糖聯用，一方面發揮了化療藥物的強力殺傷效應，另一方面竹蓀多糖對腫瘤微環境起改善作用，結果顯示兩者聯用后，荷瘤小鼠的腫瘤生長減慢，體內的MDSC比例下調。這一結果提示臨床上可以將調節腫瘤微環境的竹蓀多糖組分ZSP1與DOC聯合應用于肺癌的治療，化療藥物與腫瘤免疫的關系研究可為臨床肺癌治療方案的制定提供新的思路。