利用基因組編輯技術治療唐氏綜合征探索性研究進展

楊茹清 習海濤 谷峰 趙軍招

唐氏綜合征（Down syndrome，DS）是最常見的染色體疾病之一，其嚴重危害人類身體健康，并帶來沉重的社會和經濟負擔。DS至今仍缺乏有效的臨床治療方法，目前主要通過產前篩查和有創性產前診斷降低DS患兒的出生率。本文主要從染色體水平出發，就利用基因組編輯技術治療DS的探索性研究進展作一綜述。

1 DS的現況

DS在1866年首次由Dr.John Langdon Down提出，大量資料顯示，其臨床癥狀涉及多個器官系統，主要表現為明顯的智能障礙、特殊面容、生長發育障礙、多發畸形以及生活自理能力極度低下等，常伴先天性心臟病，＞50歲的患者多數患有阿爾茨海默病，并且白血病的發病率也較高[1-2]。據資料統計，美國和歐洲的活產DS患兒出生率分別為1/691和1/1 000[3]。統計發現，預產年齡＞30歲的孕婦DS發病率呈指數性增高，到45歲時其DS發病率高達1/30，因此推斷DS發病率與女性生育年齡密切相關[4]。近年，隨著我國二孩政策的實施，具有生育需求的高齡女性激增，但大多需通過體外受精-胚胎移植（IVF-ET，又稱試管嬰兒技術）實現妊娠[5]。Frishman等[6]對其生殖中心69例行IVF受孕（單胚移植）的患者在孕15～20周進行產前篩查，發現試管嬰兒的DS陽性率是普通人群的兩倍。

2 DS目前診療方法和致病機制

2.1 臨床DS患兒篩查方式 臨床上對預產年齡＜35歲的孕婦（除外直接行有創性產前診斷的對象），主要采取產前篩查。早孕期（孕10耀14周）篩查主要是通過母血清學檢測，主要包括游離茁-人絨毛膜促性腺激素（茁-hCG）和妊娠相關血漿蛋白-A2（PAPP-A2）[7]。有文獻報道，通過多中心聯合對入選的75 821例單胎妊娠患者（孕11耀13周+6）輔以超聲檢測，發現其可降低2%耀3%的假陽性率[8]。無創產前篩查（non-invasive prenatal tests，NIPT）作為近年快速興起的產前篩查新技術，具有準確性高和靈敏度高、假陽性率低等優勢，大多應用于高風險DS的孕婦，同時也適用于預產年齡＜35歲的孕婦[9-11]。但由于其仍存在假陽性率，且檢測成本比較高，故至今未能完全替代有創性產前診斷[12]。存在預產年齡＞35歲或夫妻一方攜帶染色體異常等高危因素時，仍需采取有創性產前診斷，這是診斷DS的金標準[4]。但這是一種侵襲性診斷方法，未能被大眾所廣泛接受。

2.2 針對DS患者的治療方法 臨床上目前尚無理想的治療方法，只能在疾病各階段根據DS患者不同臨床表現進行對癥治療。例如治療DS相關性癡呆可用卡巴拉汀或多奈哌齊等，但不能達到有效緩解且具有明顯的不良反應[13]。有研究嘗試使用Hedgehog激動劑（sonic hedgehog pathway agonist，SAG）在 Ts65Dn鼠（DS最具代表性的動物模型）上進行實驗，發現其可改善N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NM原DA）突觸可塑性和提高NMDA/琢-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體敏感性，促進小鼠小腦形態恢復，明顯改善小鼠的學習和記憶力，但尚未在臨床上普及[14]。

2.3 DS致病機制 DS主要是21號染色體異常所致，由于染色體劑量效應使部分基因異常表達，從而產生臨床表型。21號染色體上約有350個基因，但與DS病理表型相關的基因主要集中在21號染色體的長臂上，約有50個區域內的基因與DS病理表現相關，該區域稱為“DS關鍵區域（Down syndrome critical region，DSCR）”[15]。RUNX1是DS神經祖細胞的關鍵轉錄調節基因，位于DSCR內，其下調可引起與其密切相關基因的表達水平改變，如 IGFBP5、CCL2、LGR5、FBLN5 和 TLR4，尤其是CCL2[16]。RUNX1基因也可通過使GATA1s基因過表達，促使DS疾病的發生[17]。

3 新型基因療法

染色體病的治療至今難以攻克，未能達到有效治愈或緩解。隨著基因編輯技術的崛起，研究者開始嘗試通過將其致病基因失活或刪除額外21號染色體來達到治療DS的目的。

3.1 抗生素抗性基因篩選 Li等[18]于2012年在21號染色體APP基因位點上引入TK基因，之后通過更昔洛韋（ganciclovir，GCV）篩選，成功篩選出帶有TK基因的DS-多能干細胞（Down syndrome-induced pluripotent stem cells，DS-iPSC），使TK在GCV作用下轉變為細胞毒性物質，從而破壞該染色體，為臨床和基礎研究提供新的方向，但是TK基因易突變，很容易產生假陽性和脫靶的發生，且篩選陽性率低，約為10原4。

3.2 21號染色體沉默 Jiang等[19]于2013年提出了一個新的方法，通過鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）將Xist基因插入至DS-iPSCs的21號染色體Dyrk1a位點。Xist基因可引起大范圍染色體表達沉默，最終致21號染色體丟失。Xist靶向準確性高達98.5%，能導致21號染色體基因表達受抑制，但可對整個基因表達譜產生影響。2017年，Borensztein等[20]也嘗試將非編碼Xist基因導入小鼠植入前雌性胚胎的父源性X染色體上，并發現Xist基因也可誘導X染色體失活。但有研究認為此方法不能用于大片段缺失或重復的染色體，也不能完全抑制額外染色體基因的表達，因可致實驗結果出現假陰性[21]。

3.3 基因編輯21號染色體 有研究者在2014年誘導環狀染色體的形成，在異常染色體長短臂末端分別插入Loxp，在Cre重組酶介導下形成環狀染色體，在傳代培養過程中可出現靶向染色體丟失，但此方法仍存在一定局限性，尤其在編輯效率上[22]。在2017年，Zuo等[23]通過CRISPR/Cas9-SgRNA靶向染色體上的重復序列（即一條染色體上有多個靶向剪切位點）對小鼠胚胎細胞進行染色體編輯，成功將染色體刪除。這種多位點剪切可通過單個sgRNA靶向結合多個特異的染色體位點，或者通過多個sgRNA分別結合各自的特異位點消除特定染色體。通過以上方式，成功將小鼠中多余的X、Y染色體敲除，也能將DS-iPSCs的21號染色體刪除。但此研究的脫靶率問題和適用性仍待商榷，且未在人的胚胎干細胞內進行驗證（CRISPR/Cas9在人胚胎干細胞的編輯效率較其他類型細胞明顯低）。除此之外，此項研究在如何大量引入多個重復序列進行DNA切割，如何預測這些重復序列的切割效率上仍存在局限性。但也有研究認為，與ZFNs、轉錄激活子效應核酸酶（transcription acti原vator-like effector nucleases，TALENs） 相比，CRISPR/Cas9具有操作簡單便捷，費用低的優勢[24-25]。隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術成熟，可嘗試將CRISPR/Cas9和Cre/LoxP重組酶系統結合，使其在雙重作用下形成環狀染色體，通過傳代培養多代后，致環狀染色體丟失，最終使三倍體細胞恢復至二倍體細胞狀態，但目前此方法仍未得到證實。因考慮到若設計在外顯子區域，同時作用三條21號染色體，對基因的表達產生影響，可能會影響細胞的生長，不利于后續實驗的觀察，故嘗試選擇基因的內含子區域序列設計SgRNA。采用SgRNA專業設計網站（http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/）進行設計，SaCas9設計原則為SgRNA長21bp，PAM序列為NNGRRT，根據網站候選結果選擇預測脫靶率低的SgRNA。經基因數據庫網站UCSC Blast（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）檢測，確定具有較好特異性的sgRNA轉染細胞后，由于CRISPR系統作用靶位點后會使DNA產生雙鏈斷裂（double strand break，DSB），在無修復模板引入的情況下，DNA可通過非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）進行自我修復[26]?？赏ㄟ^分析Spacer區域套峰情況來評價不同CRISPR/SaCas9-SgRNA活性的高低，從而篩選出相對切割效率高的SgRNA，并用T7E1方法對篩選出來的SgRNA進行驗證，之后將篩選出的高效CRISPR/SaCas9-SgRNA靶向21號染色體特定位點，使對應的著絲粒缺失從而刪除 21 號染色體（圖 1）[27原28]。目前單用 CRISPR/Cas9 基因編輯的效率仍較低，特別是CRISPR/Cas9脫靶問題將阻礙新型基因組編輯的應用[29]。故結合兩種系統使染色體發生臂間重組從而去除對應的著絲粒，通過傳代培養多代后，致額外染色體丟失（圖2）[30]。為了能夠引入多個SgRNA進行DNA切割，也有學者提出采用CRISPR/Cas9-腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）來增加細胞感染效率從而提高編輯效率和降低脫靶率，因為AAV可以高保真和對細胞無毒性的特點對人胚胎干細胞進行基因編輯[31]。通過優化轉染環境，CRISPR/SaCas9-AAV可針對同源性的靶序列，降低脫靶問題[30]。盡管近年基因編輯技術已得到很大的改進和提升，但如何選擇性地去除靶向兩條或三條同源染色體中的特定一條染色體（父或母源性染色體），目前仍無有效的應對措施。

圖1 高效CRISPR/Cas9編輯步驟（a：高效CRISPR/Cas9-SgRNA編輯方法的過程；b：T7E1方法驗證或進一步篩選高效SgRNA）

圖2 高效CRISPR/SaCas9-SgRNA和Cre重組酶系統介導的Cre/LoxP編輯過程

我國人口基數龐大，有資料顯示DS患兒家庭經濟負擔為39.00萬元，社會經濟負擔達45.00萬元[32]。面對如此高額負擔，臨床上迫切需要尋找到有效的治療方法。新型基因編輯技術為染色體及其相關性疾病的治療提供了可供借鑒的方法，有望為家庭和社會減輕負擔。但目前，基因編輯技術仍處于基礎實驗階段，其安全性尚未解決,故還存在較大的倫理問題，不能直接應用于臨床診治。

4 小結

總之，DS是最常見、危害最大的染色體疾病之一。大部分患者具有明顯的智能落后、特殊面容、生長發育障礙和多發畸形，且動作發育和性發育均延遲，一般生活無法自理。鑒于目前尚無理想的臨床治療方法，只能最大程度地降低DS患者的出生率，且DS患者癥狀未能有效被控制，因此從根本（染色體水平）上探索治療DS的新方法顯得尤為重要。目前從細胞水平利用新型分子治療方法來探索DS的治療尤為熱門，CRISPR/Cas9系統與Cre/LoxP重組酶系統介導的染色體工程將為DS等染色體及其相關性疾病的基因治療奠定一定的基礎。但由于目前基因編輯技術在臨床試驗中涉及倫理問題，其安全性有待商榷，仍需在基礎實驗上不斷摸索。