凝血酶激活纖溶抑制物基因CPB2單核苷酸多態(tài)性與不明原因復發(fā)性流產(chǎn)的關系

李曉慶 徐曉敏

正常生理性高凝狀態(tài)下的凝血-纖溶系統(tǒng)精確調(diào)控對正常的胚胎植入和滋養(yǎng)層細胞侵襲具有重要作用，而凝血機制異常可能是導致不明原因復發(fā)性流產(chǎn)（unex原plained recurrent spontaneous abortion，URSA）的原因之一[1-2]。有研究表明，血液凝血酶激活纖溶抑制物（thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor,TAFI）水平與早期URSA的發(fā)生呈負相關，高水平TAFI可降低早期URSA發(fā)生的風險[3-4]。TAFI是由羧肽酶B2（carboxypep原tidase B2，CPB2）基因編碼并調(diào)控凝血-纖溶平衡的羧肽酶原，其功能主要為：（1）TAFI被凝血酶、凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復合體或纖溶酶激活后，降解纖維蛋白C端賴氨酸殘基以抑制纖溶酶介導的纖溶系統(tǒng)[1，3]；（2）血小板聚集后，血小板源性TAFI在血栓內(nèi)部發(fā)揮抗纖溶作用[5]；（3）激活后的TAFI可抑制纖溶和凝血系統(tǒng)引起的下游免疫反應，并抑制胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡[6]。目前，已有的CPB2單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymor原phisms，SNPs）檢測研究結(jié)果顯示，位點如 rs2146881（-438G＞A）、rs3742264（505A＞G）和 rs1926447（1040C＞T）與血漿TAFI水平和纖溶活性相關，且在URSA患者和正常人群中的分布具有顯著差異[7-9]。本研究對溫州地區(qū)女性人群中URSA患者及正常妊娠者TAFI編碼基因CPB2SNPs進行基因型分析，探討CPB2SNPs與URSA的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年1月至2016年12月在溫州市人民醫(yī)院就診并診斷為URSA的96例患者作為URSA組。納入標準：（1）夫婦雙方均為溫州地區(qū)人，既往體健，無家族遺傳病史；（2）女方為生育期婦女，常規(guī)行超聲、內(nèi)分泌、抗卵磷脂抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體、染色體、傳染病檢查結(jié)果均正常，符合URSA診斷標準[10]；（3）男方精液常規(guī)、DNA碎片分析及傳染病檢查結(jié)果均正常。另以103例同期在我院健康體檢的女性作為對照組。納入標準：（1）夫婦雙方均為溫州地區(qū)人，既往體健，無家族遺傳病史；（2）女方為生育期婦女，成功分娩一胎以上，無自然流產(chǎn)史，常規(guī)行超聲、內(nèi)分泌、抗卵磷脂抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體、染色體、傳染病檢查結(jié)果均正常；（3）男方無傳染性疾病。排除兩組蛋白C、蛋白S、抗凝血酶芋水平異常，以及已知血栓相關SNPs位點、凝血因子吁 G1691A Leiden、凝血因子域 G20210 A和MTHFR C677T突變。隨訪并記錄患者纖維蛋白原（FIB）、D-D二聚體（D-Dimer）和血小板最大聚集率（PAgT）中 PAgT（ADP）、PAgT（AA）水平。本研究經(jīng)溫州市人民醫(yī)院倫理委員會同意，受試者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料比較 收集兩組對象的一般資料并進行比較，包括年齡、BMI、妊娠史、流產(chǎn)史，以及有無孕期乙肝病毒攜帶、子宮肌瘤、瘢痕子宮、甲狀腺功能減退癥、癲癇、心血管系統(tǒng)疾病、膽道系統(tǒng)疾病史。

1.2.2 基因組DNA提取 抽取外周靜脈血2ml，采用血液基因組DNA提取試劑盒（德國凱杰公司）提取全血DNA，保存于-80益。

1.2.3 URSA相關基因目標區(qū)域捕獲和測序 目標捕獲芯片設計及測序由深圳華大基因科技服務有限公司完成。去除接頭污染和低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，采用SAMtools（http://samtools.sourceforge.net/）、GenomeAnalysisTK（https://software.broadin stitute.org/gatk/）分析樣本突變位點，篩選基因分型率＞90%且位點覆蓋度＞10reads為可信SNPs位點。通過 dbSNP（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）和 HapMap數(shù)據(jù)庫（http://www.internation原algenome.org/category/hapmap）對位點注釋，并采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜對SNPs位點進行驗證。探針設計及位點檢測由深圳華大基因科技服務有限公司MassARRAY平臺完成。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用x2檢驗，1＜理論頻數(shù)（T）＜5時采用連續(xù)性校正的x2檢驗，T＜1時采用Fisher確切概率法檢驗。Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗、兩組基因型和等位基因頻率分布比較均采用x2檢驗；關聯(lián)分析采用95%可信區(qū)間（CI）的比值比（OR）表示，并采用 B onferroni法和FDR法對結(jié)果進行多重檢驗校正。URSA患者不同CPB2SNPs 基因型間 FIB、D-Dimer、PAgT（ADP）和PAgT（AA）差異比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗。檢驗水準設為琢=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 兩組間除妊娠次數(shù)和流產(chǎn)次數(shù)外，其他一般資料的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），詳見表1。部分混雜因素在兩組中無分布。

表1 兩組一般資料的比較

2.2 CPB2 SNPs基因型和等位基因頻率分布 6個已知SNPs位點（rs2296642、rs3742264、rs7337140、rs9316179、rs2277440、rs1926447）在兩組中存在多態(tài)性且分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。URSA組rs2296642（檢驗效能為0.649）等位基因C、rs3742264（檢驗效能為0.873）等位基因 A、rs7337140（檢驗效能為 0.630）等位基因G和rs9316179（檢驗效能為0.844）等位基因C頻率分別低于對照組。經(jīng)Bonferroni法和FDR法多重檢驗校正，rs3742264和rs9316179等位基因和基因型頻率分布兩組間的差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），詳見表2。

表2 URSA組與對照組CPB2 SNPs基因型/等位基因分布

2.3 CPB2 SNPs連鎖不平衡分析 rs2296642-rs7337140（D憶=0.91，r2=0.83）和 rs3742264-rs9316179（D憶=1，r2=0.98）為強連鎖不平衡（D憶＞0.9，r2＞0.33）。URSA 組基因型組合rs3742264-rs9316179:GGTT頻率顯著高于正常組（61.5% vs 39.8%，OR=2.411，95%CI：1.364-4.263，x2=9.318，校正后P＜0.05），詳見表 3。

表3 URSA組與對照組CPB2 SNPs連鎖基因型組合分析

2.4 URSA組CPB2SNPs不同基因型間血栓指標差異分析 rs3742264 GG攜帶者PAgT（ADP）水平為78.0（72.8～83.6）%，分別低于rs3742264 GA和AA攜帶者的 81.7（76.5～86.8）%和 82.65（78.80～86.50）%，攜帶一個或兩個A等位基因與非攜帶者PAgT（ADP）水平差異有統(tǒng)計學意義（P=0.037）（圖1）。rs3742264不同基因型間FIB、D-Dimer和PAgT（AA）的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。其他SNPs不同基因型間FIB、D-Dimer、PAgT（ADP）和PAgT（AA）的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

圖1 URSA組不同rs3742264基因型患者PAgT（ADP）水平的比較

3 討論

正常妊娠過程引起的生理性高凝狀態(tài)將增加血栓形成風險，在這一狀態(tài)下的凝血機制異常引起的胎盤微血栓和胎盤功能障礙可導致URSA，而TAFI對局部凝血-纖溶系統(tǒng)精確調(diào)控至關重要[1，9]。在血栓調(diào)節(jié)蛋白的活化作用下，TAFI介導的纖溶抑制和蛋白C介導的凝血抑制可精確調(diào)控凝血功能，并共同抑制血栓導致的下游炎癥反應，且TAFI的纖溶抑制調(diào)控僅作用于局部，對血栓外的正常凝血功能無顯著影響[6，11]。Knol等[3]和Legnani等[4]分別對荷蘭與意大利URSA與血漿TAFI相關性分析表明，早期URSA患者中TAFI水平顯著低于正常人群，指出高濃度TAFI可降低URSA發(fā)病風險。ElDanasori等[9]對早期妊娠人群TAFI功能研究發(fā)現(xiàn)，除調(diào)控妊娠期凝血-纖溶平衡外，低纖溶狀態(tài)下的高濃度水平TAFI可抑制纖維蛋白降解產(chǎn)物的形成，減少胎盤滋養(yǎng)細胞的凋亡，有利于正常妊娠，尤其是早期妊娠。目前，較多CPB2基因突變位點及多態(tài)性位點已被證明與TAFI活化、催化活性、失活及血栓疾病發(fā)生等密切相關[6-8]。

本研究采取嚴格的選取標準，采用目標序列捕獲測序方法和飛行質(zhì)譜法，對溫州地區(qū)人群中96例URSA女性和103例正常妊娠史女性CPB2基因測序分析表明，rs3742264和rs9316179等位基因和基因型頻率分布在兩組間差異顯著（Bonferroni＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05），rs3742264 A（OR=0.490）和 rs9316179 C（OR=0.506）與URSA的發(fā)生呈負相關，具有保護作用。攜帶rs3742264-rs9316179 GGTT（OR=2.411）女性URSA發(fā)病風險顯著高于正常女性。其中，rs3742264（505G＞A）導致Ala147Thr錯義突變，rs9316179（678T＞C）為同義突變（SIFT和Polyphen2預測為良性突變），rs3742264和rs9316179為強連鎖不平衡（D憶＞0.9，r2＞0.33），因此，我們認為強連鎖導致rs9316179在兩組分布差異，而rs9316179并不具有臨床效應。Arauz等[12]發(fā)現(xiàn)CPB2基因多態(tài)性的改變能夠機體的凝血和纖溶狀態(tài)，人體內(nèi)TAFI的水平與基因多態(tài)性有緊密的聯(lián)系。Santos等[13]和Wang等[14]對血栓患者的研究表明，rs3742264（505G＞A）與血漿TAFI水平具有顯著相關性，攜帶rs3742264等位基因A人群TAFI水平顯著高于攜帶G位點人群。而Masini等[7]對意大利URSA人群CPB2基因的5個高TAFI水平相關SNPs位點檢測發(fā)現(xiàn)，505G＞A和1583A＞T與URSA的發(fā)生呈負相關，攜帶rs3742264等位基因A可顯著提高血漿TAFI水平，并降低URSA發(fā)病率。而我們分析rs3742264與URSA患者血栓相關指標發(fā)現(xiàn)，rs3742264 GG患者PAgT（ADP）水平顯著低于rs3742264 GA和AA患者。外周血TAFI分為血漿源性TAFI和血小板源性TAFI。Urano等[5]對血小板源性TAFI功能的綜述提示，血小板源性TAFI可促進血小板聚集并在血栓內(nèi)部迅速積聚以抑制血栓溶解。而Dempsey等[15]分析復發(fā)性流產(chǎn)患者4-7周的血小板功能后指出，再次妊娠失敗的URSA患者PAgT（ADP）水平顯著低于再次妊娠成功的URSA患者。據(jù)此，我們猜測rs3742264等位基因A可維持正常血漿TAFI水平和血小板功能，有利于正常妊娠。

綜上所述，我們對溫州地區(qū)URSA女性CPB2基因的SNPs分析發(fā)現(xiàn)，TAFI與URSA具有相關性。但由于本研究樣本量較小（部分位點檢驗效能小于0.8），一方面需要加大樣本量對實驗結(jié)果進行驗證，另一方面需要檢測突變基因攜帶人群TAFI水平，觀察基因突變是否影響TAFI抗纖溶功能，從而為溫州地區(qū)臨床URSA治療提供可靠依據(jù)。