視黃醇結合蛋白4在去勢小鼠非酒精性脂肪性肝病模型中的表達及意義

蔡泓 盧莎 陳岳明 卓廣超 張治芬

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是目前全世界最常見的慢性肝臟疾病，疾病譜包括單純非酒精性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化甚至肝細胞癌。盡管NAFLD起病隱匿，但如能積極開展早篩查、早干預，則能夠獲得良好的臨床防治效果。肝臟脂質合成代謝和轉運調控在NAFLD發病中起主要作用，其中脂肪酸合成酶（FAS）和固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）蛋白表達上調，被認為對肝脂肪變性具有重要意義。流行病學調查研究顯示，絕經后女性NALFD發生率顯著升高[1]。絕經是女性發生NAFLD的獨立危險因素[2]，但其視黃醇結合蛋白4（retinol binding protein 4,RBP4）是一種新型脂肪細胞因子，被認為可作為胰島素抵抗的標志物[3-4]。多數臨床研究發現，無論成人或兒童，血清RBP4蛋白表達水平在NAFLD患者均高于健康人群[5]，但其與NAFLD之間的相關性尚未獲得一致確認[6]。本團隊前期研究發現，外周血RBP4蛋白表達水平與絕經后女性NAFLD相關，對這一人群的NAFLD具有診斷標志物的潛在價值[7]。本研究采用小鼠高脂飲食誘導及去勢模擬女性絕經后NAFLD狀態，通過分子生物學和病理學觀察外周血清及肝組織中RBP4、FAS和SREBP-1c蛋白表達水平的改變，探討RBP4蛋白在絕經后NAFLD發病中的意義，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8周齡雌性SFP級C57BL/6小鼠30只，體重（16.1依0.8）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，于浙江中醫藥大學動物實驗中心分籠飼養。

1.1.2 高脂飼料 由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，脂質含量42%，為模擬“西方飲食”配方。對照正常飼料脂質含量12.6%。

1.1.3 主要試劑 小鼠RBP4、FAS抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；SREBP-1c抗體購自美國GENE原TEX公司；3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、茁-肌動蛋白（茁-ACTIN）及HRP標記山羊抗小鼠抗體均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；RBP4蛋白酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒購自美國ABcam公司。

1.1.4 主要儀器 倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司，Eclipse Ci型）；高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher公司，micro21R型）；蛋白凝膠電泳系統（美國Bio-rad公司，chemidoc XRS+型）等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 將30只小鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為高脂+去勢組、高脂組和對照組3組，每組10只。高脂+去勢組：去勢后，給予42%高脂飼料；去勢組：去勢后給予正常對照飼料；對照組：實施假手術后，給予正常對照飼料。去勢手術方法如下：小鼠禁食過夜后，根據體重（0.004ml/kg）予腹腔注射10%水合氯醛注射液麻醉，取下腹陰道口正中上方1～2cm處切口，分離卵巢周圍脂肪組織后結扎卵巢周圍血管及輸卵管，切除卵巢。假手術實施如下：以同樣的方法實施麻醉并打開小鼠腹腔找到卵巢，僅切除卵巢周圍少量脂肪組織，保留雙側卵巢，切除脂肪組織體積約等同于卵巢組織。所有小鼠手術后背部注射青霉素鈉20 000U/支預防感染。術后連續觀察陰道脫落細胞涂片1周，細胞涂片提示去勢小鼠陰道上皮持續無角化狀態，動情周期消失，證實去勢造模成功。造模后每周1次禁食10h后稱重，每4周1次禁食后尾靜脈采血，測得小鼠血漿ALT水平明顯升高、體重顯著增加，表示NAFLD造模成功。所有小鼠造模20周后斷頸處死，心臟取血。

1.2.2 體重及肝臟指數檢測 3組小鼠建模后每周禁食10h后稱重；處死后即刻摘取肝臟稱重。肝臟指數=肝臟濕重（g）/體重（g）伊100%。

1.2.3 病理學檢查 取小鼠同部位肝組織2份，1份經10%中性甲醛液固定、脫水、石蠟包埋、切片，脫蠟后進行HE染色，光鏡下觀察肝組織形態學改變；1份于-20益凍存后行油紅O染色，光鏡下觀察肝細胞質內脂質沉積情況。參照美國國立衛生研究院NAFLD臨床研究網病理工作組指南進行NAFLD活動性積分（NAFLD activity score，NAS）評定。NAS積分（0～8分）包含下列內容：（1）肝細胞脂肪變性：0分（＜5%）；1分（5%～33%）；2分（34%～66%）。（2）小葉內炎癥（20倍鏡計數壞死灶）：0分，無；1分（＜2個）；2分（2～4個）；3分（＞4個）。（3）肝細胞氣球樣變：0分，無；1分，少見；2分，多見。NAS＜3分可排除NASH，NAS＞4分可診斷為NASH，介于兩者之間為NASH可能。不伴有小葉內炎癥、氣球樣變和纖維化但肝脂肪變性＞33%者為NAFL。肝纖維化評分參照Ishak標準：S0為無纖維化；S1為部分門管區有纖維增生，有或無短的纖維隔膜；S2為大多數門管區有纖維增生，有或無短的纖維隔膜；S3為大多數門管區有纖維增生，偶見門管區以纖維橋連；S4為門管區纖維增生，同時伴有明顯的纖維橋連；S5為明顯的橋連，偶見結節；S6為可能或明確的肝硬化。

1.2.4 血清RBP4蛋白表達水平檢測 采用ELISA法。處死小鼠后收集心臟血液標本，即刻3 500r/min低溫離心10min，吸取上層血清-20益保存。集齊所有樣本統一交專人嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行血清RBP4蛋白水平測定。

1.2.5 肝組織RBP4蛋白表達水平檢測 采用免疫組織化學染色法。取上述未染色石蠟切片以ABC法行免疫組化染色。每張切片至少3個200倍視野拍照，保持背景光一致，采用Image-Pro Plus 6.0軟件準確選取棕黃色作為陽性的統一標準值，分析照片中陽性面積的累積光密度值（IOD）。

1.2.6 肝臟RBP4及FAS、SREBP-1c蛋白表達水平的檢測 采用Western blot法。取各組小鼠肝組織約3mm3于液氮中研碎，加入蛋白裂解混合液于冰上充分裂解。以14 000/min離心3min后取上清液。按照BCA法進行總蛋白質濃度定量。加入5伊蛋白上樣緩沖液，100益、5min裂解蛋白。制備十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），每孔加蛋白樣品 3 0滋g，在 1 00V 電壓及100min的濕轉條件下將蛋白轉至硝酸纖維素膜（NC膜）上，然后用含5豫脫脂奶粉PBS室溫封閉4益過夜。一抗室溫孵育2h，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1h，TBST緩沖液漂洗3次。使用ECL發光液顯影，自動化學發光成像系統采集圖片，ImageJ軟件分析灰度值，計算目標蛋白相對表達量。

1.2.7 統計學處理 采用SPSS 20.0和Graphpad Prime 7.0統計軟件。正態分布的計量資料以表示，方差齊時多組間比較采用F檢驗，兩兩比較采用LSD-t法，方差不齊時多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠體重、肝臟指數比較 結果顯示，在第20周時與對照組相比，高脂+去勢組小鼠體重及肝臟指數均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表1。

表1 3組小鼠體重及肝臟指數的比較

2.2 3組小鼠肝組織HE及油紅O染色結果比較 與對照組比較，HE染色下高脂+去勢組和去勢組出現明顯的肝細胞空泡樣改變，組織炎癥細胞浸潤，呈典型肝脂肪變性表現；高脂+去勢組病變程度更重，并可見靜脈周圍、肝竇輕度纖維化表現。油紅O染色下見高脂+去勢組廣泛肝細胞質內大小不等紅色脂滴聚積，呈典型肝脂肪變性表現。高脂+去勢組脂肪變性、炎癥壞死灶及氣球樣變更顯著，NAS評分更高，并達到肝纖維化S0～S1級別。3組小鼠病理檢查結果見圖1（插頁），NAS比較見表2，肝臟纖維化評分見表3。

表2 3組小鼠肝臟NAS比較

表3 3組小鼠肝臟纖維化比較

2.3 3組小鼠外周血清RBP4蛋白表達水平比較ELISA結果顯示，對照組、去勢組和高脂+去勢組小鼠外周血清中RBP4蛋白表達水平分別為（7.65依0.48）、（8.70依1.67）和（13.57依1.67）mg/ml，差異有統計學意義（P＜0.01）；進一步兩兩比較發現，高脂+去勢組血清RBP4蛋白表達水平明顯高于另外兩組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），而對照組與去勢組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 3組小鼠肝組織中RBP4蛋白表達水平比較Westernblot結果顯示，對照組、去勢組和高脂+去勢組小鼠肝組織中RBP4蛋白相對表達量分別為0.10依0.05、0.26依0.10 和 0.38依0.21，差異有統計學意義（P＜0.01）；進一步兩兩比較發現，高脂+去勢組和去勢組肝組織RBP4蛋白表達水平均明顯高于對照組（均P＜0.01），而前兩組之間表達水平的差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

免疫組織化學結果顯示，抗RBP4蛋白棕褐色免疫顆粒在肝細胞中特異性廣泛表達，其他細胞類型包括膽管細胞、肝星狀細胞、內皮細胞和炎癥細胞中無表達，陽性染色位于肝細胞胞質。對照組、去勢組和高脂+去勢組小鼠肝組織中RBP4蛋白染色IOD值分別為41.22依6.51、93.76依10.02 和 286.93依35.33，3 者比較差異有明顯統計學意義（P＜0.01）。去勢組和高脂+去勢組較對照組肝細胞RBP4蛋白表達水平明顯上調，尤以高脂+去勢組為著。RBP4蛋白表達水平與肝臟脂肪變程度呈一致性改變，見圖3（插頁）。

圖2 3組小鼠肝組織RBP4蛋白電泳圖

2.5 3組小鼠 FAS、SREBP-1c蛋白表達水平比較Western blot結果顯示，對照組、去勢組和高脂+去勢組小鼠肝組織中SREBP-1c蛋白相對表達量分別為0.25依0.08、0.41依0.10 和 0.48依0.07，FAS 蛋白相對表達量分別為 0.37依0.07、0.69依0.13 和 0.75依0.11。SREBP-1c和 FAS蛋白在3組間差異有統計學意義（P＜0.01），進一步兩兩比較發現高脂+去勢組和去勢組SREBP-1c和FAS蛋白表達水平均明顯高于對照組（均P＜0.01），但前兩組之間差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖4。

圖4 3組小鼠肝組織SREBP-1c和FAS蛋白電泳圖

3 討論

RBP4蛋白主要通過肝臟合成，其次是脂肪組織。近年來的研究認為血清RBP4蛋白參與胰島素調控，與肥胖及糖尿病相關，并被認為具有2型糖尿病診斷標志物的價值[3，8]。但是RBP4蛋白表達水平與NAFLD的關系尚未明確[6，9]。本研究團隊的前期研究發現絕經后NAFLD女性患者較健康對照者外周血清RBP4蛋白水平明顯升高，具有NAFLD診斷標志物的價值，但缺乏組織學證據。在本實驗中，筆者利用對雌性C57BL/6小鼠實施高脂飲食和去勢手術的干預，成功模擬女性絕經后NAFLD疾病狀態。結果顯示，在去勢雌性小鼠中，當肝臟出現輕度脂肪變性，即病理學檢查中發現肝細胞脂質沉積增加，但尚無明顯炎癥反應時，即有肝RBP4蛋白表達上調，且其表達水平隨著肝脂肪變性的程度加重而上升。表明肝臟RBP4蛋白水平不僅是NAFLD的敏感診斷指標，也能夠在一定程度上反映NAFLD的疾病嚴重程度。進一步對比小鼠肝臟和外周血清RBP4蛋白表達水平，筆者發現RBP4蛋白在這兩者中的表達改變呈一致性，提示血清RBP4蛋白能夠較好地反應肝組織RBP4蛋白表達水平，由此認為血清RBP4蛋白水平亦能夠較好地反映肝NAFLD的發生、發展情況。這一結果與前期臨床研究結果一致，為血清RBP4蛋白具有在絕經后女性中NAFLD診斷標志物這一價值提供了可信證據。

Xia等[10]發現RBP4蛋白可特異性激活SREBP-1c并上調其下游基因FAS的表達，從而影響肝臟脂質合成代謝。SREBP-1c蛋白活化是肝細胞合成TG的關鍵步驟，激活的SREBP-1c蛋白可在轉錄水平調控FAS蛋白，后者是乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成內源性長鏈脂肪酸的關鍵酶。筆者觀察到，脂肪變性的肝組織SREBP-1c和FAS蛋白表達水平均明顯高于正常對照，與同一樣本中RBP4蛋白表達改變一致；但隨著肝脂肪變性的進一步加重，SREBP-1c和FAS蛋白的表達并未相應上調，呈現出與RBP4蛋白是分離趨勢。提示NAFLD發病機制復雜，RBP4蛋白參與其中部分調控途徑。

目前關于性激素與RBP4蛋白表達關系的研究較少，部分臨床研究數據顯示在男性中，睪酮水平與血清RBP4蛋白水平呈正相關[11-12]。Li等[13]的臨床研究發現，肥胖女性人群中血清RBP4蛋白水平與雌激素濃度呈負相關。筆者前期研究發現無論是否肥胖，女性血清RBP4蛋白表達水平都與循環雌激素呈負相關[14]。這一現象在本實驗中獲得進一步證實。在同周齡小鼠中，去勢小鼠肝臟和血清中RBP4蛋白水平均高于接受假手術的對照組，提示絕經狀態可能上調女性RBP4蛋白的表達。但考慮到絕經狀態涉及到多種性激素的改變，包括雌激素水平下降、睪酮水平相對上升等，因此尚不能明確單一激素改變對絕經后女性血清RBP4蛋白表達水平的調控作用，本研究團隊將在進一步研究中探討各性激素成分對RBP4蛋白調控的分子機制。

綜上所述，RBP4蛋白在去勢雌性小鼠模型NAFLD的發生和發展過程中表現出良好的肝脂肪變性病情的相關性。結合相關臨床研究，血清RBP4蛋白可能成為絕經后女性NAFLD診斷標志物和治療靶點，具有良好的應用前景。