染色體畸變分析實驗條件探討

陳洋

染色體畸變分析實驗條件探討

陳洋

目的 探討如何確立外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)染色體畸變分析實驗條件, 以獲得良好的制片效果。方法 在已消毒好備用的超凈臺內(nèi), 用碘伏消毒采血管的頭部, 輕輕混勻后接種, 加入秋水仙素工作液, 經(jīng)混勻、培養(yǎng)、收集細(xì)胞并離心后, 棄上清液, 加入低滲液混勻, 給予預(yù)固定；重復(fù)固定后依細(xì)胞數(shù)量加入適量固定液, 制片、染色、氣干。于低倍鏡下細(xì)致觀察, 計數(shù)200個分裂相。結(jié)果 細(xì)胞生長良好, 分裂指數(shù)高, 能夠滿足分析要求, 染色體分散均勻, 著色良好, 長短適中, 兩條姐妹染色體大致平行分離, 著絲粒清晰。結(jié)論 尋找適合自己實驗室的實驗條件能提高染色體畸變的檢出率和閱片速度, 及時準(zhǔn)確地反映輻射損傷情況, 對放射工作人員健康進行監(jiān)護, 為意外放射性損傷事故進行生物劑量估算, 為放射患者診斷與治療提供依據(jù)。

染色體畸變；實驗條件

人體受到一定劑量的電離輻射后, 即可見到染色體的變化, 稱為染色體畸變。染色體畸變分析是放射工作人員健康監(jiān)護和慢性小劑量受眾遠期醫(yī)學(xué)效應(yīng)評價的重要指標(biāo),是最直接反映輻射損傷的檢查項目之一［1,2］。而細(xì)胞遺傳學(xué)研究的對象是活的細(xì)胞, 其手工操作復(fù)雜、中間環(huán)節(jié)多、培養(yǎng)時間長, 易受各種因素的影響, 故容易導(dǎo)致結(jié)果的偏離。為確保做出需要的合格的染色體涂片, 尋找適合的標(biāo)本制備條件顯得至關(guān)重要。本實驗室根據(jù)長期的細(xì)胞遺傳學(xué)工作經(jīng)驗,對實驗的方法做如下介紹。

1 材料與方法

1.1 材料 肝素抗凝外周全血5 ml、RPMI1640培養(yǎng)基、秋水仙素(工作濃度20 μg/ml)、低滲液(為0.075M氯化鉀)、磷酸鹽緩沖液(由濃度均為1/15M的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀以1：1體積比混合, pH值為6.8)。

1.2 方法 參照染色體畸變估算生物劑量方法(GB/T 28236-2011)及國內(nèi)文獻［3,4］并結(jié)合作者的實踐做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

1.2.1 接種與培養(yǎng) 在已消毒好備用的超凈臺內(nèi), 用碘伏消毒采血管的頭部, 將血樣輕輕混勻, 用5 ml注射器取血0.3 ml, 接種到已融化好的培養(yǎng)基中, 同時加入20 μg/ml秋水仙素工作液, 將培養(yǎng)基混勻, 置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中, 培養(yǎng)50～54 h。

1.2.2 收獲 首先收集細(xì)胞, 將培養(yǎng)基倒入10 ml離心管中, 1000 r/min離心6 min。棄上清液, 加入低滲液8 ml, 用滴管輕打混勻, 于溫箱中靜置15 min。預(yù)固定：加入固定液1 ml, 輕輕混勻。以1000 r/min離心6min。固定：棄上清液,加入固定液8 ml混勻, 靜置20 min, 然后以1000 r/min, 離心6 min。再次固定, 棄上清液, 加入6 ml固定液, 靜置20 min,然后以1000 r/min, 離心6 min。棄上清后, 依細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液, 約0.2 ml, 備用。

1.3 制片 取細(xì)胞懸液滴在備用的濕冷玻片上, 在酒精燈上過火, 寫上編號。

1.4 Giemsa染色 Giemsa染液與磷酸緩沖液制成5%的工作液, 把晾干的載玻片反蓋在上面(細(xì)胞面朝下), 將制備好的工作液灌滿染色槽, 排出氣泡, 染色20 min后用自來水沖片, 氣干。

1.5 鏡檢 在低倍鏡下尋找分散良好、長短適中的分裂相,換用油鏡對其進行細(xì)致觀察, 每張片計數(shù)200個分裂相。

2 結(jié)果

細(xì)胞生長良好, 分裂指數(shù)高, 能夠滿足分析要求, 染色體分散均勻, 著色良好, 長短適中, 兩條姐妹染色體大致平行分離, 著絲粒清晰。根據(jù)每條染色體的大小和著絲粒的位置, 區(qū)分中央著絲粒染色體、亞中央著絲粒染色體和近端著絲粒染色體。健康人的每一體細(xì)胞都含有46 條染色體, 其中有22對是男女共有的, 稱為常染色體, 另外1對則男女相差很大, 稱性染色體。見圖1。

圖1 制備完成的分散良好的染色體

3 討論

培養(yǎng)基和器皿的準(zhǔn)備、采血及血量的要求、秋水仙素的使用、低滲處理以及染色等方面均可決定染色體畸變分析實驗的成敗, 現(xiàn)做如下的討論。

①培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：培養(yǎng)基在每新?lián)Q批號時應(yīng)先與正在使用的培養(yǎng)基同時做平行樣試驗, 確認(rèn)培養(yǎng)細(xì)胞成功后才可以批量使用。②器皿的準(zhǔn)備：本實驗室所用的載玻片清洗干凈后, 要在鉻酸浸泡24 h后, 洗凈于蒸餾水中浸泡, 放置在冰箱中備用。根據(jù)文獻, 亦有人提出酸、堿性氧化電位水清洗玻璃器皿, 效果肯定, 但制水機器較昂貴, 需根據(jù)各個實驗室的實際情況決定［5］。③采血及血量要求：一定要注意消毒, 避免污染, 防止培養(yǎng)失敗。在事故現(xiàn)場或到工廠體檢采血, 遇到不能馬上培養(yǎng)的情況, 在運輸?shù)倪^程中要注意低溫保存, 又要防止凍結(jié), 同時盡量避免震動。盡量使用真空采血管采血, 以減少溶血［6］。情況允許盡快進行培養(yǎng)。外周血接種培養(yǎng)時, 要加入合適濃度的全血。每5 ml全培養(yǎng)基中加入0.3 ml全血, 如過少, 細(xì)胞數(shù)目少, 最后所得分裂相少；過多,細(xì)胞數(shù)目過多, 易造成細(xì)胞營養(yǎng)不足死亡［7］。④秋水仙素使用：作者將秋水仙素于接種時即與標(biāo)本混合, 認(rèn)為這樣的好處首先是接觸充分, 利于秋水仙素的作用；其次, 由于秋水仙素具有細(xì)胞毒性, 高濃度其鏡下表現(xiàn)可見細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)固縮, 著色深紫色, 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低［8］, 培養(yǎng)前混入秋水仙素,可減少秋水仙素的濃度(建議終濃度為0.03 μg/ml)和用量,即減輕其細(xì)胞毒作用, 是提高實驗效能的關(guān)鍵。⑤低滲處理：是實驗的關(guān)鍵步驟, 主要是時間的把握。低滲處理時間過短會造成細(xì)胞破膜膨脹不全, 染色體分散不均, 重疊現(xiàn)象嚴(yán)重,背景不清晰；而如果是低滲處理時間過長, 會造成染色體薄弱、丟失［9］。作者的經(jīng)驗是低滲時間以15 min為宜。低滲后的細(xì)胞易破裂, 所以操作不要過猛。低滲處理是整個實驗過程的關(guān)鍵, 溫度對結(jié)果影響也很大, 如果是室內(nèi)溫度低,最好將其放置于37℃培養(yǎng)箱中靜置。固定液一定要現(xiàn)用現(xiàn)配。⑥染色與制片：染色直接關(guān)系到制片的好壞, 染液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。另外, 存放玻片的冰箱應(yīng)避免存放酸堿, 酸堿度對制片效果有直接影響。染色的時間也要依滴片的厚薄及染液的濃度做適當(dāng)調(diào)整。

綜上所述, 染色體畸變分析標(biāo)本制備的每個環(huán)節(jié)都很重要, 出現(xiàn)失誤會直接影響最終制片的效果, 增加觀察的難度和檢驗結(jié)果的偏差。因此找到適合自己實驗室的實驗條件,并不斷完善和總結(jié)經(jīng)驗至關(guān)重要。另外操作規(guī)程只是室內(nèi)質(zhì)控的一部分, 人員的培訓(xùn), 儀器設(shè)備的規(guī)范管理, 培養(yǎng)基及其他試劑的質(zhì)量控制都很重要。

［1］ 李小芳,呂玉民.放射工作人員外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變和微核分析.河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2006,18(5):386-388.

［2］ 王喜愛,韓林,王平,等.放射工作人員外周血淋巴細(xì)胞微核分析.醫(yī)藥論壇雜志, 2008,29(4):32.

［3］ 肖正華.改良的人體外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)與染色體標(biāo)本的制作技術(shù).第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 1994,16(6):450.

［4］ 侯艷香.人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)染色體制備及影響因素.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床, 2013 ,10(7):874.

［5］ 左向華,陳建魁,金欣 ,等.酸、堿性氧化電位水替代硫酸洗液的實驗研究.中國醫(yī)藥導(dǎo)報, 2007,4(22):35,41.

［6］ 杜伙芬.不同靜脈采血方法對血液標(biāo)本溶血的影響研究.中外醫(yī)學(xué)研究, 2013,11 (23):89.

［7］ 任莉萍,李娟,潘亞麗, 等.人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制作技術(shù).生物學(xué)通報, 2011,46(3):54.

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［9］ 傅松濱.醫(yī)學(xué)遺傳學(xué).北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2009:63-84.

Investigation on experimental conditions of chromosome aberration

CHEN Yang.
Huizhou Occupational Disease Prevention and Control Hospital, Huizhou 516008, China

Objective To investigate the experiment condition of peripheral blood lymphocyte culture for chromosome aberration analysis to obtain a good production effect.Methods In the sterile spare super clean bench, after disinfecting the needle, inoculating in the mixed culture medium, taking colchicine solution into the mixture, the culture began.Matured cells, which were collected and centrifuged, with discarding the supernatant and adding hypotonic liquid, were pre-fixed.With the repeated fixation, cells were fixed with stationary liquid, then taken into produced chromosome slides, after dyeing and air drying.Observed at low magnification, 200 mitotic cells were counted.Results Cell growth was good with high mitotic index, which met the analytic need.The dispersion, color and length of chromosome were good, and sister chromatid separation roughly paralleled, with clear centromere.Conclusion Suitable experimental conditions can make the improvement of the detection rate of chromosome aberration and the speed of reading slides, which can reflect the radiation damage timely and accurately, take care the health of radiation workers, estimate the biological dose of radiation accident to provide the basis of the diagnosis and treatment for the patient.

Chromosome aberration; Experimental conditions

2014-04-10］

516008 惠州市職業(yè)病防治院

陳洋