綠豆多酚提取工藝優化及抗氧化活性研究

盛亞男 王長遠,2 張 舒 富天昕 馮玉超 秦海波

(1. 黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319； 2. 黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室，黑龍江 大慶 163319)

綠豆又名青小豆，為藥食兩用作物[1]，具有較高的藥用價值和良好的保健功能[2-3]。目前，綠豆的加工以傳統淀粉制品為主，造成了綠豆資源的浪費。近年來，越來越多學者開始關注綠豆蛋白[4]及膳食纖維[3]、抗性淀粉[5]、酚類物質[6]、黃酮類化合物[7]等功能成分的開發。

植物是酚類物質的主要來源。目前對植物中的酚類物質已有較多研究，Dueas等[8]采用液相色譜技術測得西班牙產蕓豆的酚類物質總量為279.68 μg/g；García-Lafuente等[9]采用化學方法測得西班牙產紫色蕓豆的總酚含量為13.41 mg；冉軍艦等[10]采用超聲波輔助纖維素酶法對蘋果中的多酚進行提取，將其純度由原來的0.67%提高至41.65%；王靜等[11]研究了用熱浸法對花生殼中多酚類物質進行提取，其提取率為5.66 mg/g；李銀平等[12]研究了微波提取葡萄籽多酚，最佳工藝條件下的提取液總酚含量為96.25 mg/g；伊文峰等[13]研究了超臨界萃取油茶中多酚的方法，總酚提取率達46.76%。程安瑋等[14]比較了4種豆類中多酚、類黃酮含量及抗氧化活性。

試驗擬對綠豆多酚提取工藝進行優化，并研究提取物的抗氧化活性，以期為綠豆功能性食品、藥品的開發提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

綠豆：市售；

無水乙醇、沒食子酸、福林酚試劑等：分析純，天津市春盛化學試劑有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氰化鉀等：分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

高速粉碎機：ZK-300B型，德清拜杰電氣有限公司；

干燥箱：DHG-9240A型，蘇州奧峰烘箱制造有限公司；

分光光度計：723A型，上海精密科學儀器有限制造公司；

恒溫水浴鍋：DK-S24型，上海雙旭電子有限公司；

高速離心機：VL-220B型，長沙湘儀有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 綠豆清洗后烘干至恒重，粉碎，過70目篩，得綠豆粉，于冰箱保存備用。

1.2.2 沒食子酸標準曲線的繪制 根據文獻[15]修改如下：稱取20 mg沒食子酸于100 mL容量瓶中定容，分別取0.00，0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL沒食子酸溶液并加水至1 mL，隨即各加入2 mol/L福林酚試劑0.5 mL混勻，于暗處放置5 min，然后加入20% Na2CO3溶液2.0 mL 后加蒸餾水并定容至25 mL，充分混勻后于室溫靜置1 h。以蒸餾水為空白對照，于760 nm下測吸光度值。以沒食子酸濃度為橫坐標(mg/mL)，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，線性回歸方程為y=91.4x+0.017(R2=0.995 6)。

1.2.3 綠豆多酚提取量的測定 根據文獻[16]修改如下：取800 μL提取液于25 mL具塞試管中，加水定容至1 mL，加入0.5 mL福林酚試劑混勻，放置暗處反應5 min，然后加入20% Na2CO3溶液2 mL并定容至25 mL，混勻后于室溫靜置1 h。測定樣品的吸光度值，并代入沒食子酸標準曲線計算多酚含量。

1.2.4 單因素試驗設計

(1) 料液比：稱取4 g綠豆粉于250 mL具塞三角瓶中，分別按料液比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)與體積分數為60%的乙醇混合，50 ℃下提取2 h，考察料液比對多酚提取量的影響。

(2) 提取時間：稱取4 g綠豆粉于250 mL具塞三角瓶中，按料液比1∶15 (g/mL)與體積分數為60%的乙醇混合，50 ℃下分別提取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h，考察提取時間對多酚提取量的影響。

(3) 提取溫度：稱取4 g綠豆粉于250 mL具塞三角瓶中，按料液比1∶15 (g/mL)與體積分數為60%的乙醇混合，分別于30，40，50，60，70 ℃下提取2 h，考察提取溫度對多酚提取量的影響。

1.2.5 響應面優化試驗設計 在單因素試驗的基礎上，以多酚提取量為響應值，以料液比、提取時間、提取溫度為因變量進行三因素三水平的響應面試驗，優化綠豆多酚提供工藝參數。

1.2.6 超氧陰離子自由基清除能力測定 根據文獻[17-18]修改如下：取Tris-HCl緩沖液(pH 8.2) 4.5 mL于具塞試管中，25 ℃恒溫水浴鍋保溫20 min。取出后立即加入綠豆多酚提取液1.0 mL及3 mmol/L鄰苯三酚溶液(25 ℃水浴鍋中預熱5 min)0.3 mL，搖勻后放入水浴鍋內反應5 min。結束后加入8 mol/L HCl溶液1 mL終止反應，于330 nm處測定吸光度值，以蒸餾水代替鄰苯三酚測得吸光度值，按式(1)計算超氧陰離子自由基清除率。

(1)

式中：

E——自由基清除能力，%；

A0——空白對照吸光值；

A1——加入提取液后吸光值。

1.2.7 亞硝酸根離子清除能力測定 根據文獻[19]修改如下：取綠豆多酚提取液2 mL于具塞試管中，加入0.005 mg/mL 亞硝酸鈉溶液1 mL，于37 ℃水浴鍋反應30 min后加入0.4%對氨基苯磺酸溶液1 mL，搖勻靜置5 min。隨即加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液0.05 mL，搖勻后加水定容至25 mL，靜置15 min后，于530 nm下測吸光值。以2.0 mL蒸餾水替代樣品，測得吸光值，按式(1)計算亞硝酸根離子清除率。

1.3 數據處理

采用Office 2010進行數據處理，每組數據進行3個平行試驗，取平均值并計算相對標準偏差，采用Design Expert 10進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比 由圖1可知，綠豆多酚的提取量隨料液比的提高而增加，當料液比達到1∶15 (g/mL)時多酚提取量達到最大值，可能是溶劑增至1∶15 (g/mL)前，乙醇使綠豆多酚與大分子物質(蛋白質、多糖)間的共價鍵斷開，溶劑越多可使其斷鍵越完全。隨后多酚提取量趨于平穩，可能是在多酚提取量達到頂峰后，增加溶劑也不能使多酚的提取含量提高。從提取效果和溶劑用量綜合考慮，選取最佳料液比為1∶15 (g/mL)。

圖1 不同料液比下的多酚提取量

2.1.2 提取時間 由圖2可知，綠豆多酚的提取量隨提取時間的增加先上升，當提取時間為3 h時多酚提取量達到峰值，之后呈現下降趨勢，可能是過長時間暴露在空氣中，多酚會氧化為醌類物質或者分解。綜合考慮，選取最佳提取時間為3 h。

圖2 不同提取時間下的多酚提取量

2.1.3 提取溫度 由圖3可知，多酚提取量隨提取溫度的升高先上升后下降，當提取溫度為50 ℃時提取量達最大值。提取溫度為40～50 ℃時，多酚提取量上升較快，可能是綠豆中部分游離酚轉化為結合酚，且在此溫度范圍內可能活化了多酚物質使其分子運動速率變大，從而使多酚物質被大量提取出來；提取溫度超過60 ℃后，多酚提取量急劇下降，可能是過高的溫度導致多酚分解或揮發。故選取最佳提取溫度為50 ℃。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 試驗設計與結果分析 根據Box-Behnken中心組合原理進行響應面設計，試驗因素水平表見表1，試驗設計與結果見表2。

利用Design Expert 10軟件對表2試驗數據進行二次多項式回歸擬合，得到以多酚含量(Y)為響應值的回歸方程：

圖3 不同提取溫度下的多酚含量

水平X1料液比(g/mL)X2提取時間/hX3提取溫度/℃-11︰513001︰1535011︰25570

表2 多酚提取量響應面試驗設計與結果

(2)

2.2.2 最佳工藝參數 采用Design Expert 10軟件優化得到最佳綠豆多酚提取工藝參數為：料液比1∶(g/mL)、提取溫度45.64 ℃、提取時間1.57 h，預測多酚提取量為11.78 mg/g。由于此參數不利于操作，因此調節為料液比1∶12 (g/mL)、提取溫度46 ℃、提取時間1.6 h。在此條件下進行驗證實驗(平行3次)，得到綠豆多酚的平均提取量為11.74 mg/g，與預測值相近，說明利用響應面分析法優化綠豆中多酚提取量的數值是真實可靠的。

表3 方差分析

2.3 綠豆多酚抗氧化活性

2.3.1 清除超氧陰離子自由基能力 通過試驗可知，樣品提取液(0.232 8 mg/mL)對超氧陰離子自由基的清除率為58.5%，介于紅小豆(0.259 2 mg/mL)(清除率50%)與豇豆(0.283 5 mg/mL)(清除率60%)之間[14]，說明綠豆多酚提取液清除能力良好。

2.3.2 清除亞硝酸根離子能力 通過試驗可知，樣品提取液對亞硝酸根離子的清除率為26.0%，說明綠豆多酚提取液具有清除亞硝酸根離子的能力。

3 結論

試驗結果表明，最佳綠豆多酚提取工藝為提取溫度46 ℃，提取時間1.6 h，料液比1∶12 (g/mL)，該條件下綠豆多酚提取量為11.74 mg/g。對綠豆多酚提取液進行抗氧化性研究發現，綠豆多酚對超氧陰離子自由基的清除率為58.5%，對亞硝酸根離子的清除率為26.0%，具有較強的抗氧化能力。試驗并未對多酚類化合物進行準確定性，后續可采用LC-MS對綠豆多酚類化合物進行定性定量分析，并采用大孔吸附樹脂進行分析純化，以篩選出起決定性作用的多酚類化合物。