酶法改性對核桃谷蛋白微觀結構及功能特性的影響

薛雨菲 張 玥 程怡媚 馬舒婕 孫 乾 李 芳 孔令明

(1. 新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052； 2. 新疆輕工職業技術學院，新疆 烏魯木齊 830021)

中國核桃產量已居世界首位，除鮮食外，大部分的核桃被用作榨油，但榨油后副產物的綜合利用，以及優質核桃蛋白的規模化、集約化深加工仍存在一定的不足。核桃蛋白中的谷蛋白與醇溶蛋白占總蛋白的70%～80%，且谷蛋白只溶于稀酸或稀堿溶液中，不溶于水或油，相對活性差，導致核桃蛋白在食品領域中的應用較少[1]。

酶解可使深藏于蛋白質內部的親水性基團逐漸暴露而改善蛋白質的功能特性[2-3]。谷氨酰胺轉氨酶(transglutaminase，TG)的交聯化能促進蛋白質分子向超大型、網狀化形成，從而使得蛋白分子具有更為強勁的凝膠化性能[4]。Hu等[5]在研究中指出，酶法可改善蛋白質的乳化活性，但相應的乳化穩定性卻有一定程度的下降。酶法改性能使改性后的大豆蛋白在乳化穩定性[6]、起泡性、凝膠性以及熱穩定性上有較為顯著的改變，因此對蛋白質進行酶法改性并分析蛋白質分子的構象，對解釋蛋白質結構與其功能特性的關系，以及擴大在食品等領域的應用具有一定的重要意義[7]。

試驗擬選用TG酶改性核桃蛋白，輔以光譜圖分析，探究蛋白親疏水性的變化，定性定量分析蛋白的二級、三級結構以及基團變化，旨在為酶法改性核桃蛋白使核桃餅粕中的優質蛋白得到更為全面的利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃餅粕：新疆中亞食品研發中心有限公司；

核桃谷蛋白(WG)：實驗室自制；

大豆油：新疆友好集團股份有限公司；

復合蛋白酶：120 U/mg，南寧龐博生物工程有限公司；

谷氨酰胺轉氨酶：100 U/g，北京索來寶科技有限公司；

透析袋：截留相對分子質量8 000～14 000，北京卓立漢光儀器有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、NaOH、HCl：分析純，天津致遠化學試劑有限公司；

1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)、5-5’-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)、乙二胺四乙酸(EDTA)：分析純，美國Sigma公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

便攜式數顯pH計：Testo205型，德圖儀表(深圳)有限公司；

電子天平：PL203型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-S-6型，北京市永光明醫療儀器有限公司；

低速離心機：TDL-5-A型，上海安亭科學儀器廠；

紫外—可見分光光度計：TU-1810PC型，北京普析通用儀器有限責任公司；

電熱鼓風干燥箱：DHG-9140A型，上海一恒科學儀器有限公司；

真空冷凍干燥機：ALPHA 1-2型，德國 Marin Christ公司；

定時恒溫磁力攪拌器：RSH-1DR型，上海貝侖儀器設備有限公司；

漩渦振蕩器：GL-866型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

圓二色譜儀：J-810型，日本JASCO公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 核桃谷蛋白及改性蛋白的制備

(1) 核桃谷蛋白工藝提取：根據文獻[8]進行修改。

核桃餅粕→脫脂核桃粕→加去離子水→離心→沉淀→加NaCl→離心→沉淀→加70%乙醇→離心→沉淀→加NaOH調pH值→離心→上清液→加HCl調pH至等電點→離心→沉淀→水洗至中性→真空冷凍干燥→核桃谷蛋白

(2) 脫酰胺谷蛋白工藝流程：

WG→制備溶液(蛋白質濃度6%～8%，質量分數)→攪拌→調pH 7.0→加酶(40 ℃，40 min，酶用量0.3%)→滅酶(90 ℃水浴10 min)→冷卻→水洗至中性→真空冷凍干燥→脫酰胺酶解核桃谷蛋白(CPMP)

(3) 交聯化工藝流程：

WG→加磷酸緩沖液溶解(蛋白質濃度6%～8%，質量分數)→攪拌→加酶→混勻振蕩反應→滅酶(90 ℃水浴10 min)→冷卻→水洗至中性→真空冷凍干燥→TG酶改性核桃谷蛋白(TGMP)

1.3.2 熒光分光光度分析 根據文獻[9]修改如下：將蛋白稀釋于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，使其質量濃度為0.3 mg/mL。調整激發波長為310 nm，發射波長為450 nm，選擇發射波長的測定范圍為400～500 nm。激發和發射狹縫均為5 nm，掃描速率1 200 nm/min，掃描電壓450 mV。每個樣品重復做3次掃描。

1.3.3 紫外分光光度分析 將蛋白稀釋于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，使其質量濃度為0.1 mg/mL。取約5 mL樣液倒入1 cm石英比色皿中，用分光光度計測定樣品吸光度值，掃描波長200～400 nm。每個樣品重復做3次掃描。

1.3.4 巰基與二硫鍵測定

(1) 游離巰基含量：取30 mg蛋白樣品分散于Ellman’s試劑中， 4 800 r/min離心15 min，412 nm處測量，每個樣品重復做3次測定。

(2) 總巰基含量：稱取30 mg蛋白溶于10.0 mL混合試劑(精確稱取20.84 g Tris、13.51 g甘氨酸、2.98 g EDTA二鈉和960.96 g碳酰二胺，加去離子水定容至1 000 mL)中， 412 nm處測量，每個樣品重復做3次測定。按式(1)計算巰基含量。

(1)

式中：

SH——巰基含量，μmol/g；

73.53——消光轉化系數，μmol/L；

A412——412 nm處測得的吸光度；

D——上清液稀釋倍數；

C——上清液中蛋白含量，mg/mL。

(3) 二硫鍵：取50 mg蛋白樣品分散于100 μL Tris-base緩沖液中，再加入到NTSB溶液中，室溫下靜置1 h，10 000 r/min離心10 min，412 nm處測量，對照組加入NTSB溶液。

1.3.5 圓二色光譜分析 精確稱取WG樣品溶解于pH 7.0的磷酸緩沖液中，使蛋白濃度為0.3 mg/mL。在25 ℃條件下放置3 h，采用圓二色光譜儀測定WG的圓二色性。取約5 mL樣液置于2 mm石英比色皿中，掃描波長190～250 nm，掃描速率100 nm/min，響應溫度25 ℃，靈敏度100 mdeg/cm，分辨率0.5 nm。所測出的圖譜需扣除緩沖液的空白差，每個樣液重復掃描8次取平均值，蛋白的二級結構采用JASCO結構軟件進行分析，圓二色性以殘基摩爾橢圓率表示(℃·cm2/dmol)。

1.3.6 氮溶指數的測定 參照文獻[10]并做一定修改，精確稱量2 g凍干后的酶解產物，分散于去離子水中，定容至50 mL。室溫下振蕩2 h，4 500 r/min離心20 min，取5 mL上清液用凱氏定氮法測定蛋白質含量，每個樣品重復做3次測定。按式(2)計算氮溶指數。

(2)

式中：

NSI——酶解產物的氮溶指數，%；

N1——5 mL上清液中的可溶性氮，mg；

N2——2 g樣品中的總氮，mg；

1.3.7 持水性的測定 參考Paredeslopez等[11]的方法并略作修改，準確稱取0.10 g WG和改性蛋白置于離心管中，加入10 mL去離子水，4 500 r/min離心15 min。稱取樣品和離心管質量，每個樣品重復做3次測定。按式(3) 計算持水性。

(3)

式中：

WHC——持水性，g/g；

M0——樣品質量，g；

M1——離心管與樣品總質量，g；

M2——離心管與沉淀物質量，g。

1.3.8 持油性的測定 依照Pedroche等[12]的方法并略作修改，準確稱取0.10 g WG和改性蛋白置于離心管中，加入大豆油5 mL，漩渦式震動60 s，3 300 r/min離心15 min，吸紙吸去殘留油脂，每個樣品重復做3次測定。按式(4)計算持油性。

(4)

式中：

FBI——持油性，g/g；

M0——樣品質量，g；

M1——離心管與樣品總質量，g；

M2——吸油后離心管與樣品總質量，g。

1.3.9 乳化及乳化穩定性的測定

(1) 乳化性：根據文獻[13]略作修改。取5 mL樣液于25 mL蒸餾水和20 mL大豆油混合液中，漩渦震蕩60 s，2 500 r/min離心乳化5 min，讀取乳化層高度，測定3次取平均值。按式(5)計算乳化性。

(5)

式中：

EA——乳化性，%；

H1——離心管中乳化層高度，cm；

H——離心管中液體總高度，cm。

(2) 乳化穩定性：稱取5 g樣品溶于100 mL蒸餾水中，調節至pH 7.0，加入50 mL大豆油，高速攪拌器中10 000 r/min 均質2 min，50 ℃水浴30 min后，測出此時的乳化層高度，并且記錄30 min后的乳化層高度。測定3次取平均值。按式(6)計算乳化穩定性。

(6)

式中：

ES——乳化穩定性，%；

H0——0 min乳化層高度，cm；

H1——30 min乳化層高度，cm。

1.3.10 起泡性與泡沫穩定性的測定 根據文獻[14]修改如下，按1%的質量濃度將樣品溶解于pH 7.0的10 mmol/L 磷酸緩沖溶液中，取10.0 mL置于25 mL離心管中，10 000 r/min均質2 min；快速記錄均質停止時的總體積和放置30 min后的總體積，測定3次取平均值。按式(7)、(8)分別計算起泡性與泡沫穩定性。

(7)

(8)

式中：

FA——起泡性，%；

FS——泡沫穩定性，%；

V0——初始樣液體積，mL；

V1——均質放置0 min后樣液總體積，mL；

V2——均質放置30 min后樣液總體積，mL。

1.4 數據處理

所有試驗重復3次，運用Excel 2003進行圖形繪制，光譜圖采用系統自帶軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜分析

由圖1可知，在310 nm的激發波長處所產生的熒光光譜主要是由于谷蛋白中存在一定量的色氨酸所造成的，譜圖上顯示的熒光峰實質為色氨酸基團由于光激發產生的電子躍遷所導致，峰的位置為428～432 nm。利用CPMP與TGMP適度地酶解蛋白，使蛋白分子水解成多肽以及肽鏈，打開了蛋白質卷曲的結構，分子鏈逐漸展開，側鏈的改變會影響蛋白質三級結構的變化[15]。改變蛋白質內部結構以及蛋白質所處的微環境，都可以使蛋白質中氨基酸發生相應變化，一部分色氨酸從疏水性區域游離到親水性區域，其氨基酸殘基暴露在極性環境下，導致其熒光強度下降；另一部分色氨酸逐漸被包埋于分子內部，其所處的微環境極性降低，也導致了熒光強度下降[16]。親水性基團的暴露，疏水基團的包埋，使得親水性極大增強，溶解度極大提高。

圖1 核桃谷蛋白與改性蛋白的熒光光譜

2.2 紫外光譜分析

由圖2可知，WG的最大紫外吸收波長為284 nm，反映了WG的紫外吸收主要是其蛋白內的色氨酸和絡氨酸殘基發生必變所引起的。WG的最高紫外吸收峰出現在284 nm處的0.470，而CPMP是0.498，其高低順序依次為TGMP>CPMP>WG。所有改性蛋白的吸收峰均出現在275～279 nm，蛋白紫外吸收峰出現了藍移，說明色氨酸、絡氨酸等殘基基團所處微環境的極性狀態發生了改變，這種改變也相應會引起肽鍵的斷裂[17]。

圖2 核桃谷蛋白與改性蛋白的紫外光譜

2.3 巰基與二硫鍵分析

由圖3可知，WG的游離巰基和二硫鍵含量分別為22.78，7.02 μmol/g。WG的大部分巰基都游離在蛋白質表面，而改性蛋白的巰基相對WG均是包埋在分子內部。在蛋白質空間結構中，巰基和二硫鍵是維持蛋白分子空間結構穩定以及改變一定功能特性的重要化學鍵[18]，這些化學鍵的斷裂、結合、重組都可使蛋白質的更高級結構產生一定的變化，而這些變化往往又與蛋白質的功能特性緊密結合。

2.4 圓二色光譜分析

如圖3所示，210 nm處的負峰顯示了蛋白質具有α-螺旋結構，而α-螺旋結構過于穩定，在一定程度上會阻止蛋白的構象發生改變，蛋白質趨于穩定狀態，不利于蛋白質功能特性的改變[19]；相比α-螺旋結構，β-折疊與無規則卷曲結構使得蛋白穩定性較差。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖4 核桃谷蛋白與改性蛋白的圓二色光譜

由表1可知，未改性的WG二級結構主要為β-折疊，且α-螺旋結構占17.62%，為改性蛋白的1.27倍。經酶法改性的CPMP與TGMP雖有一定變化趨勢，但表現不明顯；β-轉角結構在整體上變化不明顯，無規則卷曲結構在一定程度上有所變化。

2.5 功能指標的測定

由表2可知，通過改性前后的數據對比分析，CPMP與TGMP的氮溶指數分別為40.61%，34.29%，氮溶指數提高了133.01%，96.75%，持水性提高了23.19%，22.25%，與沈敏江等[20]的研究結果一致。Tsumura等[21]研究發現，酶法改性可有效改善大豆蛋白的功能特性，主要與蛋白質的水解和交聯有關；沈敏江等[20]研究發現氮溶指數由8.74%上升至78.16%。

CPMP與TGMP的持油性均出現了一定的下降，可能是因為酶法改性較為溫和，在暴露親水基團的同時也在釋放疏水性基團，而預先暴露出來的親水性氨基酸阻止了疏水性氨基酸的暴露，導致疏水性氨基酸不能完全暴露，持油性較差。TG酶的催化作用會導致蛋白質的二級和三級結構發生變化，隨著多肽的產生和肽鏈的舒展，更多的疏水基團與疏水區域的暴露會直接增加蛋白的持油性，但提高幅度并不明顯；而因為TG酶所產生的交聯化作用，其空間網絡結構逐漸緊密，且TG酶也相應發生脫酰胺化，因此也會提升蛋白的持水性。楊淼等[22]認為，在水油兩相比中，適當提高油相比例可以提高大豆分離蛋白的凝膠持水性，提高大豆分離蛋白的乳化性狀；而在大豆蛋白的相應產品中，TG酶常被用作一種凝膠乳化劑以提升產品的乳化能力和膠凝程度[23]。

表1 核桃谷蛋白與改性蛋白二級結構變化對比

表2 改性前后功能特性比較

在乳化特性與起泡特性上，采用酶法改性處理WG能夠提高氮溶指數，同時對乳化特性有一定程度的提高。Guan等[24]指出，一般情況下，蛋白質的溶解性較好，蛋白的其他功能特性也相應較好；而沈敏江等[20]卻認為，使用酶法改性WG，雖然其乳化性有一定提升，但乳化穩定性卻呈現出顯著下降，并指出可能是因為酶解破壞了核桃蛋白的內部結構，導致非極性基團逐漸暴露，因為酶解也會相應生成多肽和小分子肽，這些肽類黏滯在油分子表面，阻止了核桃蛋白的乳化穩定性。

由表2還可知，CPMP與TGMP的起泡特性無明顯變化。Kong等[25]發現有限的酶解可使蛋白質分子向多肽轉變，而多肽鏈相比蛋白質具有較高的表面活性，而這種活性會促使核桃蛋白功能特性有所改善。Gan等[26]則發現TG酶對小麥蛋白的改性會顯著提高蛋白的乳化性、起泡性以及凝膠性，且提高幅度均在55%以上，但其穩定性卻都有略微的降低。這是由于TG酶能夠對蛋白質中的谷氨酸以及賴氨酸殘基產生交聯化，這種交聯化反應使得蛋白質分子間以及蛋白質分子內都逐漸發生交聯，交聯促進了蛋白分子的緊密結構，優化了蛋白的空間網絡結構，這些原因均改善了蛋白功能特性。

3 結論

研究發現，經復合蛋白酶與TG酶改性后的核桃蛋白其溶解度有較大幅度的提升，持水能力也表現出一定的升高，但持油性卻有一定的下降；乳化特性與起泡特性也有相應的變化。結合光譜圖的分析，更加明確了核桃蛋白在酶法改性時，蛋白的親水性以及疏水性會發生相應的變化，蛋白中氨基酸殘基的極性狀態也會發生相應的變化，其內部的色氨酸與外部環境(pH、溫度等)的改變，也會引發蛋白質高級結構的改變；也為核桃的定性分析提供了相應的理論依據。 蛋白的游離巰基是決定親水性的主要原因，蛋白分子內部以及分子間化學鍵的變化，能反作用于其所形成的高級結構變化，而結構表征性的變化又會影響到蛋白外在的功能特性的變化。但目前試驗仍處于對結構表征的論述，未從蛋白組學的角度出發，對作用于氨基酸位點上的深層次機理加以闡述，且在實際應用中還有待于更深入的開發和完善。