pH及離子強度對燕麥分離蛋白功能特性及亞基特性的影響

王美玉 王 愈 陳振家 閆 舟 劉龍龍

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學，山西 晉中 030801；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所，山西 太原 030031)

貯藏蛋白是多數(shù)植物種子的主要蛋白質(zhì)，在種子萌發(fā)過程中作為氮、硫和碳水化合物的來源。貯藏蛋白主要分為球蛋白和醇溶蛋白，雙子葉植物種子的主要貯藏蛋白質(zhì)為球蛋白，而單子葉植物則為醇溶蛋白，多數(shù)谷物種子的主要貯藏蛋白質(zhì)為醇溶蛋白，而燕麥和大米只含有少量的醇溶蛋白胺(5%～10%)，其主要貯藏蛋白為球蛋白[1]，并與雙子葉植物中的11S球蛋白相似，有研究[2]表明燕麥和大米貯藏蛋白在水中的溶解性比雙子葉植物的差，燕麥球蛋白的溶解需要0.8～1.0 mol/L的NaCl，而水稻球蛋白的溶解需要變性溶劑。燕麥球蛋白含量高，占燕麥總蛋白含量的50%～80%，氨基酸比例合理，其中賴氨酸含量為4.2%，高于除大米以外的其他谷物[3]，因此近年來受到廣泛關(guān)注。

影響蛋白質(zhì)溶解度的因素有pH、離子強度、溶劑類型及溫度。Ma等[4]研究表明，在極端酸性或堿性條件下，β-折疊結(jié)構(gòu)(1 626，1 634，1 682 cm-1)條帶向更高或更低的波數(shù)移動，表明構(gòu)象發(fā)生了變化；在一定的鹽濃度下，1 626，1 634 cm-1譜帶向上移動，1 634 cm-1峰強度明顯減小。球蛋白組分呈U型溶解度曲線，在pH 6～7時溶解度最??；在曲線的酸性、堿性端，溶解度均達到90%以上[5]。前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，高鹽離子強度下燕麥球蛋白有更高的溶解性，而球蛋白為燕麥分離蛋白的主要成分。

在前人研究的基礎(chǔ)上，試驗擬擴大pH及離子強度范圍，研究燕麥分離蛋白的功能特性及亞基特性，利用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)從亞基角度解釋不同pH及離子強度下，可溶性燕麥分離蛋白的亞基特性及其與部分功能特性之間的關(guān)系，旨在為燕麥分離蛋白的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥：壩莜一號，山西農(nóng)業(yè)科學院；

氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

考馬斯亮藍G250、30%制膠劑、四甲基乙二胺、SDS、甘油、低分子量蛋白質(zhì)Marker：分析純，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外—可見分光光度計：UV-1200型，上海美譜達儀器有限公司；

pH計：ST3100型，奧豪斯儀器(常州)有限公司；

磁力加熱攪拌器：791型，金壇市科析儀器有限公司；

高速離心機：HC-2064型，安徽中科中佳科學儀器有限公司；

電泳儀：DYY-7C型，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 燕麥分離蛋白的制備 根據(jù)文獻[7]修改如下，挑選籽粒飽滿，無病蟲害的燕麥磨粉，燕麥粉與石油醚按1∶5(g/mL)混合攪拌過夜，然后經(jīng)抽濾、晾干除去石油醚即為燕麥脫脂粉。燕麥脫脂粉與水按1∶10(g/mL)混合并調(diào)節(jié)pH為9.0，50 ℃下恒溫提取2 h， 4 000 r/min離心15 min，取上清液，調(diào)節(jié)上清液pH為5.0，4 000 r/min離心15 min，沉淀勻漿后調(diào)節(jié)pH至中性，經(jīng)真空冷凍干燥，即為燕麥分離蛋白(含量為80.3%)。

1.3.2 不同pH及離子強度下可溶性燕麥分離蛋白濃度的測定 配制質(zhì)量分數(shù)為1%的燕麥分離蛋白溶液，攪拌0.5 h，用1 mol/L HCl及NaOH溶液分別調(diào)節(jié)pH至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，加入NaCl溶液分別配成濃度梯度為0.01，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90，1.00 mol/L的溶液，攪拌15 min，10 000 r/min離心10 min，上清液用考馬斯亮藍法[8]測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定 參照何幗英等[9]方法，略作修改。配制質(zhì)量分數(shù)5%的燕麥分離蛋白溶液，攪拌0.5 h。用1 mol/L HCl及NaOH溶液調(diào)節(jié)為不同pH；加入NaCl調(diào)節(jié)為不同離子強度，分別取10 mL蛋白溶液，13 500 r/min均質(zhì)2 min，分別記錄均質(zhì)停止時及放置30 min后泡沫的體積。按式(1)、(2)計算起泡性及泡沫穩(wěn)定性。

(1)

(2)

式中：

FA——起泡性，%；

FS——泡沫穩(wěn)定性，%；

V0——攪打停止時泡沫總體積，mL；

V——攪打前液體體積，mL；

V30——放置30 min后泡沫體積，mL。

1.3.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定 參照管驍?shù)萚10]方法，略作修改。配制質(zhì)量分數(shù)1%的燕麥分離蛋白溶液，攪拌0.5 h。用1 mol/L HCl及NaOH溶液調(diào)節(jié)為不同pH；加入NaCl調(diào)節(jié)為不同離子強度，分別取15 mL蛋白溶液與5 mL大豆油混合，13 500 r/min均質(zhì)2 min。分別從瓶底取20 μL均質(zhì)停止時及放置30 min后的乳濁液，與5 mL SDS(0.1%，質(zhì)量分數(shù))溶液混合，在500 nm下測定吸光值(以SDS溶液為空白)。按式(3)、(4)計算乳化性及乳化穩(wěn)定性。

(3)

(4)

式中：

EAI——乳化性，m2/g；

ESI——乳化穩(wěn)定性，min；

A0——初始乳化液吸光值；

C——樣品濃度，g/mL；

φ——乳化液中油相的比例；

L——比色杯光徑，mm；

N——稀釋倍數(shù)；

A30——30 min后乳化液的吸光值。

1.3.5 SDS-PAGE 根據(jù)文獻[11]略作修改，取1.3.2中離心所得上清液進行電泳試驗，濃縮膠與分離膠濃度分別為5%，12%，樣品上樣量6 μL，恒壓電泳，電流40 mA，濃縮膠電壓100 V，分離膠電壓150 V。電泳結(jié)束后，電泳膠片固定3 h，再通過染色，脫色，最后成像儀成像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗重復(fù)3次，使用Excel 2010和Origin 8.0進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH與離子強度對燕麥分離蛋白溶解性的影響

由圖1可知，燕麥分離蛋白溶解度呈U型曲線，pH在5.0～6.0(等電點)時，溶解度最低，與管驍?shù)萚5，10]研究結(jié)果相近，而許英一等[12]則認為pH為4.0時燕麥分離蛋白溶解度最低，但pH為6.0時其溶解度同樣也較低，可能是由于原料或提取條件的不同造成的。因此，燕麥分離蛋白在pH 5.0～6.0缺乏靜電排斥作用，蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用遠大于帶電殘基產(chǎn)生的親水性和水合作用，燕麥分離蛋白此時幾乎完全不溶解，而在堿性pH下具有較高的溶解度。

圖1 pH對燕麥分離蛋白溶解特性的影響

由圖2可知，添加鹽離子(<0.05 mol/L)會使燕麥分離蛋白的溶解度降低，表現(xiàn)為鹽析，一方面為燕麥分離蛋白含有較高比例的非極性區(qū)域，降低了溶解度[13]，另一方面為少量鹽離子與水分子相互作用，減少了燕麥分離蛋白表面親水基團與水分子間的相互作用[14]，促進蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用，使蛋白質(zhì)分子間發(fā)生聚集，導致溶解性降低。繼續(xù)添加鹽離子，燕麥分離蛋白的溶解度逐漸升高，表現(xiàn)為鹽溶，與Hari等[2]的報道一致，與大豆蛋白溶解特性相反[15]。燕麥球蛋白在酸性多肽的C末端附近含有8個富含谷氨酰胺的氨基酸重復(fù)序列(大豆球蛋白中該區(qū)域由不同長度的酸性殘基組成)，該區(qū)域位于球蛋白表面，暴露于溶劑，與其他球蛋白相比，燕麥球蛋白的親水性較低，部分解釋了燕麥球蛋白溶解度所需的鹽濃度較高[16]。

圖2 離子強度對燕麥分離蛋白溶解特性的影響

Figure 2 Effect of ionic strength on the dissolution characteristics of oat protein isolate

2.2 pH與離子強度對燕麥分離蛋白起泡性的影響

由圖3可知，燕麥分離蛋白在等電點(pH 5.0～6.0)時起泡性最差，泡沫僅由蛋白質(zhì)的可溶部分參與形成，但泡沫最為穩(wěn)定，與Guan等[17]的研究一致。等電點時，蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)間缺乏靜電排斥相互作用，有利于界面上的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用及形成黏稠的膜。

圖3 pH對燕麥分離蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，加入鹽離子后燕麥分離蛋白起泡性明顯降低。當NaCl濃度<0.1 mol/L 時，燕麥分離蛋白的起泡性隨鹽離子濃度的增加而降低，可能是NaCl對燕麥分離蛋白的鹽析作用；當NaCl濃度>0.1 mol/L 時，隨著鹽離子濃度的進一步增加，燕麥分離蛋白的起泡性迅速下降并趨于平緩，可能是燕麥分離蛋白對NaCl的鹽溶作用；當NaCl濃度達到0.8 mol/L時，燕麥分離蛋白表現(xiàn)出良好的起泡性，與何幗英等[18]的研究結(jié)果相近。不同離子強度下，燕麥分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性先上升后下降，隨后趨于平緩。當NaCl濃度為0.1 mol/L時，燕麥分離蛋白泡沫穩(wěn)定性最佳，當NaCl濃度≥0.2 mol/L時，隨離子強度的增加，泡沫穩(wěn)定性無明顯變化。

圖4 離子強度對燕麥分離蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

Figure 4 Effects of different ionic strength on foaming and foam stability of oat protein isolate

2.3 pH與離子強度對燕麥分離蛋白乳化性的影響

由圖5可知，在等電點附近，由于蛋白微溶且缺乏靜電排斥力，燕麥分離蛋白乳化性較差，在堿性條件下，燕麥分離蛋白表現(xiàn)出了良好的乳化性，與Guan等[17]的研究一致。在酸性和中性條件下，乳化穩(wěn)定性變化趨勢與乳化性變化趨勢相反；而堿性條件下，乳化性與乳化穩(wěn)定性變化趨勢相同，在一定范圍內(nèi)隨pH的增加，乳化性及乳化穩(wěn)定性均不斷升高。

圖5 pH對燕麥分離蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，鹽離子的添加整體降低了燕麥分離蛋白的乳化性能。當NaCl濃度<0.2 mol/L時，燕麥分離蛋白的乳化活性隨鹽離子濃度的增加而降低，NaCl濃度為0.2 mol/L時，乳化性最差；當NaCl濃度>0.2 mol/L時，乳化性先上升后下降，NaCl濃度為0.7 mol/L 時乳化性最佳，與何幗英等[18]研究結(jié)果相近。乳化穩(wěn)定性變化趨勢與乳化性相反，NaCl濃度為0.3 mol/L時乳化穩(wěn)定性最高。

圖6 離子強度對燕麥分離蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

Figure 6 Effect of different ionic strength on emulsifying and emulsifying stability of oat protein isolate

2.4 SDS-PAGE

由圖7可知，當?shù)鞍踪|(zhì)在中性pH附近時，靜電排斥能量小于其他穩(wěn)定蛋白質(zhì)相互作用的能量，因此大部分蛋白較為穩(wěn)定；在極端pH時，高靜電荷引起的強烈的分子內(nèi)靜電排斥力導致蛋白質(zhì)分子的腫脹和展開。在堿性條件下，可溶性燕麥分離蛋白亞基之間無明顯區(qū)別，可能是由于其中含有少量的天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)[19]殘基。而酸性條件對可溶性燕麥分離蛋白亞基影響較大，pH由2.0～6.0，在可溶性蛋白濃度逐漸降低的過程中，相對分子質(zhì)量>66.2 kDa的亞基先完全消失，隨后是相對分子質(zhì)量為22.0～43.0 kDa的亞基，最后是相對分子質(zhì)量為43.0～66.2 kDa的亞基。pH為2.0，3.0時，酸性條件造成了肽鏈的部分水解，形成了相對分子質(zhì)量為31.0～43.0 kDa的亞基條帶，其中pH 2.0時形成的亞基相對分子質(zhì)量較pH 3.0時大，被還原后形成了14.4～22.0 kDa 的小分子多肽。

由圖8可知，不同離子強度對可溶性燕麥分離蛋白的亞基條帶影響顯著，對比圖7中pH 7.0時亞基條帶可知，由于鹽離子的加入，造成了可溶性燕麥分離蛋白肽鏈的斷裂(可能是二硫鍵的斷裂)，形成了相對分子質(zhì)量分別為43.0，66.2 kDa的多肽鏈，且被還原后未發(fā)生變化，說明斷裂后的多肽鏈不含二硫鍵。當NaCl濃度為0.05 mol/L 時，可溶性蛋白主要由相對分子質(zhì)量為43.0 kDa 的亞基組成，隨著鹽離子濃度的增加，相對分子質(zhì)量為66.2 kDa多肽先溶解，隨后相對分子質(zhì)量為43.0～66.2 kDa的亞基(酸性多肽與堿性多肽通過二硫鍵連接形成)溶解。

M. 低分子量蛋白Marker 1～12. 依次為pH 2.0，3.0，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0

圖7 不同pH條件下燕麥分離蛋白SDS-PAGE圖

Figure 7 SDS-PAGE analysis of oat protein isolate under different pH conditions

M. 低分子量蛋白Marker 1～12. 依次為NaCl濃度0.01，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90，1.00 mol/L

圖8 不同離子強度下燕麥分離蛋白SDS-PAGE圖

Figure 8 SDS-PAGE analysis of oat protein isolate under different ionic strength conditions

3 結(jié)論

燕麥分離蛋白在pH 5.0～6.0時溶解度最低，起泡性最低，泡沫穩(wěn)定性最高，在堿性條件下乳化性及乳化穩(wěn)定性較高；pH 2.0，3.0的酸性條件造成了可溶性燕麥分離蛋白肽鏈的部分水解，形成了相對分子質(zhì)量為31.0～43.0 kDa 的亞基條帶，堿性條件下無明顯區(qū)別。NaCl濃度為0.05 mol/L時溶解度最低，NaCl濃度為0.6～0.9 mol/L 時，起泡性、泡沫穩(wěn)定性及乳化性均較高；溶解度最低時，可溶性蛋白主要是由相對分子質(zhì)量為43.0 kDa 的亞基組成，NaCl的加入造成了可溶性燕麥分離蛋白肽鏈的斷裂，形成了相對分子質(zhì)量分別為43.0，66.2 kDa的多肽鏈。試驗僅研究了pH及離子強度對燕麥分離蛋白的功能特性與亞基特性的影響，后續(xù)可采用現(xiàn)代高新技術(shù)分析其他相關(guān)性質(zhì)指標。