UPLC-MS/MS法同時檢測人血漿中拉莫三嗪和卡馬西平濃度

陳 曉，朱 斌，楊 陽，安曉娟，胡翠玲

0 引言

拉莫三嗪(Lamotrigine，LTG)和卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)均為治療癲癇的常用藥物，二者單用或聯合應用治療復雜性癲癇發作。無論是實施臨床治療藥物監測，以達到合理個體化用藥，還是進行藥代動力學研究，均需要準確快速的血藥濃度檢測方法。目前，文獻報道的方法包括高效液相色譜法(HPLC)[1-4]，高效液相色譜質譜聯用法(HPLC-MS/MS)[5-7]等，多為檢測單一藥物，且分析時間長，同時檢測多種藥物將會大大提高藥物分析效率。而且文獻報道的前處理方法-液液萃取法或固相萃取[2,3,6-9]比較費時費力。本研究旨在建立一種樣品處理簡便、快速、準確的超高液液相色譜-質譜聯用(UPLC-MS/MS)法，同時測定拉莫三嗪和卡馬西平的血藥濃度，以滿足臨床研究的需要。

1 材料與方法

1.1 試劑與標準品 卡馬西平標準品(美國Sigma公司，批號：C0450000，純度≥98%)；拉莫三嗪標準品(美國Sigma公司，批號：T6062，純度≥98%)；內標：西替利嗪(Cetirizine，CTZ)標準品(美國Sigma公司，批號：C0980650，純度≥98%)；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；試驗用水為超純水。

1.2 儀器 串聯質譜儀4000 QTRAP (美國Applied Biosystems公司)；液相色譜儀ACQUITY UPLC H-Class System(美國沃特世公司)；渦旋混合器(XW-80A，上海醫科大學儀器廠)；低速離心機(5417R 型，EPPENDORF，德國)；分析天平(TB-114，DENVER，USA)；Millipore Direct-Q3型純水機等。

1.3 檢測條件

1.3.1 液相條件 采用Waters ACQUITY BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱，流速：0.3 ml/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μl，樣品分析時間為3 min，流動相為甲醇(A)和0.1%甲酸(B梯度洗脫。流動相梯度洗脫程序：在 0～1.0 min 5% A，1.0～1.9 min線性增加至95%，在 1.9～ 2.4 min內A保持95%，在2.4～2.6 min內A線性降低至5%，然后A相保持5%至3 min，總分析時間為3 min。

1.3.2 質譜條件 采用電噴霧(ESI)離子源，選用多反應監測(MRM)在正離子電離模式下進行質譜掃描測定，拉莫三嗪、卡馬西平和內標西替利嗪的離子對分別為m/z256.0→211.2、m/z237.0→194.1和m/z389.2→201.2。儀器參數設置如下，Cur：10 psi，CAD：medium，IS：5 000 eV，TEM：300 ℃，GS1：50 psi，GS2：20 psi，DP：120 V，EP：10 V；CXP：15 V，CE：37 V(LTG)、27 V(CBZ)、27 V(CTZ )。每個通道時間為200 ms。

1.4 溶液配制 精密稱取拉莫三嗪標準品0.010 0 g，用 1.0 ml甲醇溶解，移入10.0 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻即得1 mg/ml標準儲備液，置于冰箱-20 ℃保存。再用甲醇梯度稀釋，配制各濃度100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 ng/ml的標準工作液，置于冰箱-20 ℃保存。

卡馬西平標準儲備液的配制方法同上所述，得1.0 mg/ml。同樣再用甲醇梯度稀釋，配制各濃度 100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 ng/ml的標準工作液，置于冰箱-20 ℃保存。然后將等體積的拉莫三嗪和卡馬西平標準工作液混合，得50、100、250、500、1 000、2 500、5 000、10 000 ng/ml的混合標曲標準工作液，另外，配制QC標準工作液低、中、高濃度分別為100、2000、8 000 ng/ml，置于冰箱-20 ℃保存待用。

精密稱取內標西替利嗪標準品 0.010 0 g，用1 ml甲醇溶解，移入10 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻即得1.0 ng/ml的標準儲備液，用甲醇梯度稀釋至1 000 ng/ml，置于冰箱-20 ℃保存待用。

1.5 樣本處理 精密吸取血漿樣品100 μl，置于1.5 ml的離心管中，加入內標西替利嗪溶液10 μl，旋渦10 s混勻后，加入500 μl甲醇，旋渦振蕩1 min，15 000 r/min離心10 min，吸上清液150 μl于進樣瓶，進樣10 μl。

2 方法學確證

2.1 專屬性 LTG、CBZ的準離子峰分別為m/z256.0和m/z237.0，二級質譜分析生成的主要碎片離子分別為m/z211.2和m/z194.1，內標CTZ的準離子峰和主要碎片離子峰分別為m/z389.2和m/z201.2。LTG、CBZ和CTZ標準品相應的二級全掃描質譜圖見圖 1。取空白血漿100 μl，按“1.5”項下方法操作，得到相應色譜圖；另取空白血漿100 μl 3份，分別加入質量濃度均為50 ng/ml的LTG標準溶液、CBZ標準溶液及混合標準溶液各10 μl，按“1.5”項下操作，得到相應色譜圖，見圖2。

圖1 質譜圖

注：A.拉莫三嗪m/z256.0→211.2，B.卡馬西平m/z237.0→194.1，C.西替利嗪m/z389.2→201.2

2.2 標準曲線和線性范圍 精密吸取人空白血漿 90 μl，根據標準曲線濃度范圍分別加入LTG和CBZ的混合標準工作液 10 μl，輕渦混勻制備成系列標準曲線樣品，加入內標CTZ溶液10 μl，按上述“1.5”生物樣品與處理方法處理后，進行UPLC分析，橫坐標為已知濃度，縱坐標為分析所得不同濃度分析物峰面積與待測物峰面積之比，使用加權最小二乘法進行回歸運算(權重系數為1/X2)，得LTG標準曲線回歸方程：Y=0.001 1X-0.002 8 (R2=0.999 5)，CBZ標準曲線方程為：Y=0.002 2X-0.024 8 (R2=0.997 5)。結果表明，LTG和CBZ血藥濃度均在 5～1 000 ng/ml范圍內線性關系良好。LTG和CBZ的定量下限均為5 ng/ml(S/N>10)。

圖2 色譜圖

2.3 回收率和基質效應 制備人血漿中LTG和CBZ各質控濃度的樣品(平行5個樣本)，按上述“1.5”項生物樣品與處理方法處理后，進行 UPLC-MS/MS分析，得目標分析物峰面積為A1，目標分析物峰面積經標準曲線換算得濃度 C；取空白人血漿樣品數份，按“1.5”樣品處理方法處理后，用所得溶液配制各質控濃度的分析物等標溶液(各平行 5 個樣本)，進行UPLC-MS/MS 分析，得峰面積為A2；按“(A1/A2)×100%”計算提取回收率，LTG和CBZ提取回收率分別為81.3%～84.9 %和82.7～87.3 %。同時，制備目標分析物等濃度標液，進樣分析，得其峰面積為A3，依“(A2/A3)×100%”來考察基質效應。通過相對標準偏差(RSD)反映基質效應的大小。基質效應RSD值應在±15%范圍內。

2.4 精密度和準確度 制備LTG和CBZ各質控濃度生物樣品(平行5個樣本)，按上述“1.5”生物樣品與處理方法處理后，進行UPLC-MS/MS 分析，考察方法的批內精密度和準確度；通過在連續不同天處理并檢測3個合格的分析批樣品。考察方法的批間精密度和準確度。精密度的RSD值在±15%范圍內，準確度為85%～115%，見表1。

2.5 穩定性實驗 見表2。取低(10 ng/ml )、中(200 ng/ml )、高(800 ng/ml )的血漿樣品，分別于室溫放置 0、12 h 后測定其回收率。每個條件下每個濃度點考察6份平行樣本，結果表明，處理后的血漿樣品室溫放置 12 h內穩定(RSD<12.5%)。同法配制低、中、高質量濃度的標準品血漿樣品各5份置于-20 ℃放置30 d，按“1.5”項下方法操作，測定其回收率，考察長期穩定性(RSD<13.4 %)。配制低、中、高質量濃度的標準品血漿樣品各5份，置于-20 ℃，冷凍-解冷凍循環3次后，進樣分析，考察反復凍融穩定性(RSD<14.8 %)。

表1 提取回收率、精密度和準確度結果(n=5)

表2 樣本穩定性考察結果(n=5)

3 討論

本研究采用甲醇蛋白沉淀的前處理方法，簡便快速，同時使用ACQUITY BEH C18UPLC色譜柱，優化流動相后分析時間縮短至3 min，大大提高了分析效率。而且同時檢測卡馬西平和拉莫三嗪，標曲范圍覆蓋臨床患者體內的藥物濃度，非常適用于臨床藥代動力學研究和治療藥物監測。