UV-VIS法測定濕熱消顆粒中總黃酮含量的不確定度評價

梁國成，陳舒茵，黃小鷗，馮文勇，方建康，覃 翔

0 引言

慢性前列腺炎(Chronic prostatitis，CP)是男科常見病及多發病，發病率高，臨床以排尿異常、慢性盆腔疼痛為特征[1-4]。CP的臨床發病機制較為復雜且尚未明確，因此，在CP的臨床治療中，難以準確對患者的病情做出根本改善。西醫主要根據患者的臨床病癥進行針對性抗感染消炎治療[5-7]，然而患者在臨床對癥緩解治療的效果欠佳，并且常因多種因素在短期治愈后較為容易復發[8-9]。中藥復方制劑對前列腺炎的療效較好[10-13]，因此，研究開發有效的藥物防治CP，尤其是療效肯定、不良反應少、質量可控的中藥、中成藥尤為必要。

濕熱消顆粒是由濕熱消湯改劑型研制而成，濕熱消湯是我院男性科名老中醫長期用于防治CP的有效經驗方，由金錢草、虎杖、板藍根、黃芪等12味中藥組成，前期的臨床研究表明，濕熱消方對防治CP具有良好的治療效果[10-11]，而總黃酮為防治CP的有效成分之一[14-15]。

本試驗采用紫外-可見分光光度法(UV-VIS)測定制劑中總黃酮的含量，UV-VIS法因其操作簡單、適用性廣等特點，已廣泛應用于諸如總物質含量測定等藥品分析領域。而試驗樣品在制備、測量過程中，常常會因為人為操作習慣、測量誤差、結果讀數誤差或者測量用具自身誤差等原因而不可避免地在測定過程和結果中引入一定誤差，因此，試驗所得的測量值只能得到真實值的近似值，存在一定的誤差。不確定度的概念是合理的表征賦予被測量值的分散性與測量結果相關聯的參數[16-17]，是目前研究者較為認可的一種科學、合理的質量控制方法和驗證手段[18]，能夠較為準確地評估測量結果。

本文建立了UV-VIS法測定濕熱消顆粒中總黃酮含量的方法，并根據歐洲化學委員會頒布的Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement要求[19]，對測定方法和結果進行不確定度評定，探討該法試驗過程中可能的不確定因素，提高試驗數據和檢測結果的準確性和可靠性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AE240分析天平(梅特勒-托利多公司)，DK-S26電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)，53WBI微機型紫外-可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)，玻璃器皿為天玻牌A級。

1.2 試劑與試藥 濕熱消顆粒(自制，批號：1800508、1800511、1800517)，槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-201610，含量測定用)，乙醇(上海沃凱生物技術有限公司，分析純)，無水乙醇(廣東翁江化學試劑有限公司，分析純)，AlCl3(天津市大茂化學試劑廠，分析純)，NaCH3COOH(天津市大茂化學試劑廠，分析純)，純化水(自制)。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品10.13 mg，以70%乙醇定容于50 ml容量瓶中，再精密量取5 ml至10 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度線，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品15 g，精密加入70%乙醇100 ml，超聲1 h[20]，過濾，定容于250 ml容量瓶中，精密移取續濾液10 ml至25 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度線，搖勻，即得。

2.2 檢測波長選擇 分別取對照品溶液、供試品溶液各2 ml，置于10 ml容量瓶中，20 ℃水浴加熱，先加入1.2 ml的0.1 mol/L的AlCl3，后加入1.8 ml的1 mol/L的NaCH3COOH溶液，反應2 min后取出，用70%乙醇定容，搖勻，待溶液溫度降至室溫[21]，以相應試劑為空白，在200～500 nm范圍進行紫外波長掃描，結果顯示，槲皮素對照品溶液與供試品溶液于442 nm處有最大吸收，光譜圖基本一致，最終選擇檢測波長為442 nm，結果見圖1～圖3。

2.3 線性及線性范圍的考察 精密量取槲皮素對照品溶液1、2、3、4、5、6、7 ml分別置于10 ml容量瓶中，20 ℃水浴加熱，先加入1.2 ml的AlCl3(0.1 mol/L)，后加入1.8 ml的NaCH3COOH溶液(1 mol/L)，反應2 min后取出，用70%乙醇定容，搖勻，待溶液溫度降至室溫，以相應試劑為空白，紫外-可見分光光度計在波長為442 nm處測量吸光度值。

以吸光度A(Y)為縱坐標，槲皮素含量(mg)(X)為橫坐標繪制標準曲線。

2.4 方法學驗證

2.4.1 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下供試品，在442 nm波長下，連續測定5次，其吸光度的RSD為0.12%，表明精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 精密吸取“2.1.2”項下供試品，在442 nm波長下，分別于0、1、2、4、8、12 h測定，測定6次，其吸光度的RSD為0.23%，表明溶液在12 h內的穩定性良好。

2.4.3 重現性試驗 取同一批次的濕熱消顆粒5份，分別按“2.1.2”項下平行制備供試品溶液，依法進行測定，結果RSD為0.19%，表明樣品重現性良好。

2.4.4 回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品5份，分別精密加入槲皮素對照品，照“2.1.2”項下制備供試品溶液，依法測定總黃酮含量，計算加樣回收率，結果見表1。

2.5 樣品含量測定 取不同3個批次的濕熱消顆粒，分別按“2.1.2”項下平行制備供試品溶液，并依法進行測定，結果見表2。

表1 槲皮素回收率試驗結果(mg)

表2 樣品含量測定結果(mg/mg)

3 不確定度的評定

3.1 不確定度的來源 試驗過程中，不確定度主要來源于儀器和人工操作偏差。本試驗過程中，不確定度的來源主要有：對照品溶液制備過程引入的不確定度、供試品溶液制備過程引入的不確定度、標準曲線擬合引入的不確定度、樣品重復測定引入的不確定度以及回收率測定所引入的不確定度[22-25]。

3.2 量化不確定度分量

3.2.1 對照品溶液制備引入的不確定度 對照品制備過程中使用十萬分之一天平精密稱取10.13 mg，以70%乙醇定容于50 ml容量瓶(A級)中，再以5 ml單標移液管(A級)精密量取5 ml至10 ml容量瓶中，70%乙醇定容至刻度。故對照品溶液制備引入的不確定度U1有：①對照品稱量的不確定度M1，電子天平經檢定為1級，允許誤差±0.100 mg；②溶液配制的不確定度V1，溶液配制過程用到50 ml、10 ml、5 ml單標移液管(A級)，據國家計量檢定規程JJG196-2006要求[26]，允許誤差分別為±0.050 ml、±0.020 ml、±0.025 ml。其分量評定結果見表3。

3.2.2 供試品溶液制備引入的不確定度 用十萬分之一天平精密稱取本品30 g，置于100 ml容量瓶(A級)中并精密加入70%乙醇100 ml，超聲1 h，過濾，定容于250 ml容量瓶中，精密移取續濾液10 ml至25 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度線，搖勻。供試品溶液制備引入的不確定度U2有：①供試品稱量的不確定度M2，電子天平經檢定為1級，允許誤差±0.100 mg；②溶液配制的不確定度V2，溶液配制過程用到100 ml、25 ml、10 ml允許誤差分別為±0.010 ml、±0.030 ml、±0.020 ml。其分量評定結果見表4。

表3 對照品溶液的不確定度評定

表4 供試品溶液的不確定度評定

V2=0.003 5 ml,U2=0.003 5 mg

3.2.3 標準曲線擬合引入的不確定度 本試驗配制了7個濃度含量的標準溶液Ci：0.010 13、0.020 26、0.030 39、0.040 52、0.050 65、0.060 72、0.070 84 mg，平均濃度C0=0.039 05 mg，在442 nm處測得平均吸光度Ai分別為：0.152、0.288、0.392、0.507、0.624、0.737、0.862，每個平行測定2次，用最小二乘法擬合，得到直線方程A=11.507X+0.042 8。見表5。

表5 線性最小二乘法擬合

取1份供試品，平行測定2次，由此得平均含量C0=0.031 7 mg。

3.2.4 樣品重復測定的不確定度 取“2.4.1”同一份樣品重復測定，5次測定得到含量分別為0.034 2、0.031 8、0.040 8、0.031 4、0.042 5 mg，平均含量為0.036 1 mg。

3.3 計算合成標準不確定度 各相對不確定度分量值及貢獻率見表6。

3.4 擴展不確定度和報告不確定度 95%CI下，包含因子k=2，則相對擴展不確定度U95=k×U×100%=2×0.116 9×100%=23.38%。由試驗測定濕熱消顆粒中總黃酮含量W=0.031 9 mg/mg，故擴展不確定度為：U95(W)=0.031 9×0.233 8=0.007 5 mg/mg。故本次試驗測定得到濕熱消顆粒中總黃酮含量為：W=(0.031 9±0.007 5)mg/mg。

表6 UV-VIS測定濕熱消顆粒中總黃酮不確定度分量評定表

4 討論

總黃酮的含量測定方法有UV-VIS、HPLC、CE等[27-29]，其中以UV-VIS操作較為簡單快速。黃酮及類黃酮化合物在200～800 nm光譜范圍的掃描表明，部分黃酮類化合物吸收較弱或無最大吸收[30]，所以，采用UV-VIS法測定總黃酮含量常常顯色后進行測定，其中應用最多的為金屬離子絡合法[31]。該法是黃酮類化合物在酸性或堿性條件下與金屬離子發生絡合反應后形成有色的鰲合物而產生較強的紫外吸收而測定含量，常用的顯色方法有AlCl3、AlCl3-CHCOONa、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH等。本試驗采用AlCl3-CHCOONa法顯色，效果良好。

UV-VIS以分子吸收光譜為基礎，利用化合物分子在200～800 nm光譜范圍具有紫外吸收的特點進行分析和測定，或經顯色后產生紫外吸收而測定[31]，具有設備簡單、適用性廣、準確度和精密度高等優點，已在中藥含量測定如總黃酮含量分析中廣泛應用，且發揮著越來越重要的作用。在分析過程中，引入不確定度的概念，可最大程度地彌補因操作步驟繁多或操作不熟練、以及計量器具等因素而產生的誤差，同時操作人員在試驗過程中應盡可能減少操作步驟，提高操作熟練度，盡量避免使用小容量計量器具進行量取、定容等，以減少因主觀和客觀因素而引入的不確定度，提高測量結果的可靠性。

試驗過程中，定量方法的相對擴展不確定度U95為23.38%，其中樣品重復測定不確定度U4為33.92%，對樣本含量測定結果影響較大?？赡艿脑蛴校孩俦敬卧囼灢淮_定度分量有由儀器測量的不確定度分量、樣品重復測定的不確定度分量和加標準品回收率引入的不確定度分量，包含了重復性的不確定度，且后兩者相關系數為-1，故應減除重復性；②根據“重復性測量誤差與被測量的規格大小呈正比，而與被測量的級別高低呈反比”的普遍規律[32]，在進行樣品的重復測定時，應盡可能采用較低規格(即濃度)的樣品，或采用更高一級的標準樣品(即純度)，校準測量儀器，并給出儀器的量傳誤差[33]，從而得到比較滿意的擴展不確定度，最終降低樣品重復測定的不確定度U4。