櫻桃葉單寧的分布及累積特征

張超越，張茹涵，梁棟，李海剛，王守箐，劉林

（臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東臨沂 276005）

單寧是由植物細胞合成的一類天然酚類化合物，產(chǎn)量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[1]。單寧可分為水解性單寧和非水解性單寧，后者又稱凝縮性單寧或原花青素[1-5]。水解性單寧是沒食子酸與多元醇酯化產(chǎn)物及其衍生物，最常見的多元醇是β-D-葡萄糖[2-3]。非水解性單寧是黃酮類化合物的聚合物，最常見的單體是兒茶素和表兒茶素[4-5]。單寧溶于水，能吸收紫外線，與蛋白質(zhì)反應(yīng)，引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生變化，從而破壞其正常功能，這一性質(zhì)賦予單寧殺菌功能[6]。單寧與蛋白質(zhì)作用的性質(zhì)使草食性動物不愿取食那些積累大量單寧的植物，從而使植物免受這些動物傷害[7]。紫外線破壞蛋白質(zhì)和DNA 等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，細胞通過積累單寧保護蛋白質(zhì)和DNA 免受紫外輻射傷害[8-9]。因此，積累單寧是植物的一種自我保護機制[6-9]。研究表明，單寧具有抗氧化及抑制腫瘤等生物活性[10]。由于上述特性，單寧在食品、化妝品、醫(yī)藥、制革、造紙、冶金、水處理等許多領(lǐng)域得到應(yīng)用。

了解植物葉器官單寧分布的特征，有助于分析其抵御病原菌侵染和紫外輻射傷害機制。櫻桃是栽培面積較大的果樹，但櫻桃葉單寧積累的特征研究還鮮有報道。本研究采用組織化學(xué)和超微技術(shù)對櫻桃葉單寧分布進行了顯微和超微分析，了解了單寧積累及其分布特點，從而揭示櫻桃單寧的紫外輻射和病原菌防御機制，同時拓寬對櫻桃生物學(xué)的認識，為單寧資源研究增添信息，也為櫻桃葉的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試櫻桃（Cerasus pseudocerasus）品種為金紅櫻桃，栽種于臨沂大學(xué)校園內(nèi)，樹齡6 年，常規(guī)管理，長勢良好。

1.2 組織化學(xué)方法

四氧化鋨檢測法：單寧與四氧化鋨作用產(chǎn)生棕色至黑色產(chǎn)物[11-13]，據(jù)此，從櫻桃樹上剪取葉片，將葉片組織用2.5%戊二醛溶液固定后在1%四氧化鋨溶液中浸泡4 h，再后用酒精脫水脫色，包埋于樹脂中，切片，厚度為1 μm，顯微鏡下觀察單寧。

三氯化鐵檢測法：利用單寧與三氯化鐵反應(yīng)產(chǎn)生藍綠色的性質(zhì)[14-15]，從櫻桃樹上取葉片，將葉片組織固定后在三氯化鐵溶液中浸泡12 h，然后用酒精脫水脫色，包埋于樹脂中，切片，厚度1 μm，顯微鏡下觀察單寧。

1.3 透射電子顯微技術(shù)

從樹上取下葉片，將小于1 mm2的組織小塊用2.5%戊二醛溶液（用0.05 mol/L 磷酸緩沖液配制）固定12 h，再用1%四氧化鋨溶液固定4 h，酒精脫水，丙酮置換酒精，之后用Epon-812 樹脂包埋，切片，厚度為60 nm，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染[13]，透射電鏡下觀察單寧。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃葉片的顯微特征

圖1 顯示了櫻桃葉片的顯微結(jié)構(gòu)，由圖可知，櫻桃葉片由表皮、葉肉和葉脈三個基本部分組成。上表皮細胞比下表皮細胞大，因而上表皮細胞數(shù)目較下表皮少。葉肉分化為柵欄層和海綿層，柵欄層細胞排列緊密，細胞間隙極小，而海綿組織細胞排列疏松，細胞間隙大。大小不同的葉脈構(gòu)成脈序，大葉脈由維管束及其與表皮間的薄壁組織構(gòu)成，薄壁細胞與相鄰的葉肉細胞不同，細胞較大，葉綠體少，常見簇狀結(jié)晶體。維管束位于海綿組織，距葉片下表皮較近。維管束被一層排列緊密的葉肉細胞包圍，這層細胞構(gòu)成維管束鞘。木質(zhì)部位于近上表皮側(cè)，韌皮部位于近下表皮側(cè)，韌皮部細胞較木質(zhì)部細胞小。

圖1 葉片顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of leaf blade

2.2 櫻桃幼葉單寧分布特征

圖2（見下頁）顯示了櫻桃幼葉單寧的分布特征，由圖可知，幼葉葉片沒有展開時，細胞排列緊密，沒有細胞間隙，葉肉細胞尚未分化，沒有柵欄組織和海綿組織之分。維管組織處于發(fā)育早期，還沒有分化形成木質(zhì)部和韌皮部（圖2A）。

綜合不同方法的檢測結(jié)果，可以得出，單寧在幼葉中的積累有如下特點：第一，單寧不是在所有細胞中積累，而是只在部分細胞中積累（圖2A-C），積累單寧的細胞與不積累單寧的細胞相鄰，表明單寧不會從一個細胞向另一個細胞擴散，這是由單寧大分子特征及其與蛋白質(zhì)作用的性質(zhì)所決定的；第二，維管組織邊緣細胞積累較多單寧，維管組織與表皮之間的細胞也積累較多單寧（圖2A），表皮細胞積累較多單寧，將分化為葉肉的那些細胞積累較少單寧（圖2B、C）。第三，單寧只在液泡中積累，被完全限制在液泡內(nèi)（圖2D、E）。

圖2 幼葉中的單寧Fig.2 Tannin accumulation in young leaves

2.3 櫻桃成熟葉片中單寧的分布

圖3 顯示了櫻桃成熟葉片中單寧的分布，由圖可知，葉片成熟時，葉肉組織分化成柵欄層和海綿層，前者排列緊密，后者排列疏松（圖3A），維管組織分化出木質(zhì)部和韌皮部（圖3B）。成熟葉單寧積累有如下特點：第一，葉肉細胞，包括柵欄細胞、海綿細胞和圍繞維管組織的葉肉細胞，即維管束鞘細胞積累較多單寧（圖3A-D），相反，表皮（圖3A、E）、維管組織（圖3A、B、E、F）和維管組織與表皮之間的細胞（圖3A）積累單寧明顯較少；第二，各種組織中不是所有細胞都積累單寧，通常有少量細胞不積累單寧；第三，與幼葉一樣，單寧在液泡中積累（圖3A-F）。

圖3 成熟葉中的單寧Fig.3 Tannin accumulation in mature leaves

3 討論

植物單寧的產(chǎn)生和積累與環(huán)境因素有關(guān)，特別是紫外輻射。紫外線照射增加，單寧的積累也會增多[8-9]。單寧具有吸收紫外線的性質(zhì)，植物細胞積累這種酚類化合物，吸收紫外線，從而保護細胞中的DNA 和蛋白質(zhì)不受紫外線損傷[8-9]。此外，單寧還具有殺菌功能，細胞積累單寧能夠防御病原菌入侵[6]。本研究表明，櫻桃幼葉和成熟葉均積累單寧，單寧分布在各種類型細胞中，這樣的積累和分布特征顯示，櫻桃葉具有以單寧為基礎(chǔ)的紫外線和病原菌防御機制，保護葉細胞不受紫外輻射傷害，阻止病原菌入侵。除單寧外，櫻桃葉還可能積累其他酚類化合物，即單寧不一定是櫻桃葉唯一的紫外線和病原菌防御機制。

試驗還發(fā)現(xiàn)幼葉表皮、維管組織以及維管組織與表皮間的細胞積累較多單寧，預(yù)定成為葉肉組織的細胞積累較少單寧；成熟葉的葉肉組織積累較多單寧，維管組織和表皮積累單寧較少，單寧的分布特征為櫻桃葉片發(fā)育和行使功能提供了有效保護。維管組織細胞體積小、數(shù)量多，染色質(zhì)含量高，對紫外輻射較為敏感，單寧積累形成紫外線防御機制，對維管組織保護具有重大意義。特別在維管組織發(fā)育早期，維管薄壁細胞還在發(fā)生分裂活動，分裂期的細胞對紫外輻射高度敏感，過度紫外輻射會使維管組織發(fā)育受到嚴重影響，從而進一步影響光合產(chǎn)物的韌皮部卸載，造成葉肉組織營養(yǎng)不良，最終影響葉片正常發(fā)育，因而在維管組織發(fā)育早期防御紫外輻射極為必要，幼葉維管組織外層細胞及維管組織與表皮之間的細胞積累大量單寧，為維管組織罩上吸收紫外輻射的單寧“帽”，有效地保護維管組織。幼葉中將分化為葉肉的細胞積累較少單寧，但是表皮積累較多單寧，為這些細胞提供了保護。成熟葉中，葉肉細胞負責光合作用，制造光合產(chǎn)物，維管組織負責將光合產(chǎn)物裝載到韌皮部，運輸?shù)交ā⒐麑崱⑶o尖、根尖等生長旺盛的部位，為細胞分裂、生長和分化提供物質(zhì)基礎(chǔ)，葉肉組織積累較多單寧，能夠有效防御紫外輻射傷害，保證光合作用正常進行，同時給積累單寧較少的維管組織提供保護，保證光合產(chǎn)物正常運輸。

很多酚類化合物具有很強的抗氧化活性、殺菌能力和抑制腫瘤的療效[6-9]，這些特點決定酚類化合物具有多方面的應(yīng)用。作為大分子酚類化合物，單寧不僅在制革業(yè)具有重要應(yīng)用價值，在食品、醫(yī)藥等其他領(lǐng)域也有重要價值，如葡萄酒的抗氧化活性就來自于葡萄中的單寧。有研究表明，將富含單寧的柿葉加入飼料，可明顯減少小鼠對飼料中脂類物質(zhì)的吸收，降低體內(nèi)的膽固醇、甘油酯和脂過氧化物的水平，減輕體重[10]。柿葉已被加工為茶，進入市場。電子顯微鏡下觀察，櫻桃葉與柿葉中的單寧具有非常相似的特征，因此櫻桃葉具有潛在的開發(fā)價值。