富灣銀礦的微生物多樣性研究

高敬華 李楠 郭士杰 姜學霞

摘? ?要：本文主要是研究了富灣銀礦微生物的多樣性，通過采集富灣銀礦土壤樣品，利用16S rRNA基因序列分析細菌基因文庫，通過系統(tǒng)進化分析確定了該礦區(qū)的微生物群落組成。結(jié)果表明，富灣銀礦土壤的主要微生物群落包括變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和浮霉菌門（Planctomycetes）以及未分類的細菌類群，揭示了富灣銀礦的土壤中存在著豐富的細菌，這為探討微生物修復礦區(qū)土壤污染提供理論的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：礦區(qū)? 多樣性? 16S rRNA? 重金屬污染

中圖分類號：S154? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1674-098X（2019）06（a）-0109-03

重金屬污染積累性強，具有不可逆性。我國金屬礦產(chǎn)資源豐厚，在礦山的開發(fā)、運送和礦石的冶煉過程中出現(xiàn)的尾礦、尾渣、粉塵顆粒等固液氣體廢棄物危害了礦區(qū)周圍土壤和水體，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和周邊環(huán)境良性發(fā)展造成潛在性危害[1]。重金屬長期積累會危害人的智力發(fā)展以及身體發(fā)育[2]。 生物修復技術(shù)治理礦區(qū)重金屬污染是關(guān)鍵技術(shù)，運用微生物的生化反應和代謝過程轉(zhuǎn)化和治理礦區(qū)重金屬污染，具備資金投入少、操作過程簡單、沒有產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點，是目前研究該領(lǐng)域的熱點[3]。

廣東富灣銀礦位于廣東省佛山市高明區(qū)富灣鎮(zhèn)荷城街道東北部（華南褶皺系粵中凹陷內(nèi)三洲上古生代斷陷盆地的西北邊緣），北北東向恩平一從化斷裂帶與東西向高要一惠來構(gòu)造帶交匯部位[4-5]，面積約 2.83km2。銀礦比鄰高明富灣大學城，周邊村落居民群較多。高明礦產(chǎn)資源豐富，其中富灣銀礦蘊藏量最大的金屬礦之，富灣銀礦曾因被擬定開采開發(fā)利用而引起公眾關(guān)注。

本研究以富灣銀礦已開采的地方土壤為研究對象進行樣品采集，采用非培養(yǎng)的方法，直接提取土樣中微生物的基因組DNA，通過PCR擴增、連接和轉(zhuǎn)化構(gòu)建了該礦區(qū)16S rRNA基因克隆文庫，對礦區(qū)土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行了研究，揭示了富灣銀礦重金屬污染與微生物之間的內(nèi)在聯(lián)系，為其他污染礦區(qū)土壤的微生物生態(tài)研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1? 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究選取廣東省佛山市高明區(qū)富灣銀礦區(qū)的土壤進行采集。地理坐標為：東徑 112°48′01″，北緯 23°00′00″，根據(jù)礦區(qū)面積大小、地勢情況和污染狀況進行梅花形布點采樣，采取0～15cm土層混合土樣，四分法去掉多余土壤，裝入無菌袋中，貼上標簽，立即帶回實驗室。

1.2 富灣銀礦細菌DNA提取

用強勁土壤DNA提取試劑盒提取菌種基因組的DNA，通用引物27F和1492R進行16S rRNA基因的PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳檢測。

1.3 測序與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

基因擴增產(chǎn)物純化后送往上海美吉醫(yī)藥生物有限公司進行序列測定，共測定100條序列，將所得序列結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索，同時下載與未知細菌同源性相對較高的序列，利用ClustalX比對分析， MEGA軟件的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。確定樣品中的細菌群落多樣性，利用Microsoft Excel 2010繪制細菌組成分布情況。

2? 結(jié)果

本次實驗結(jié)果共計得到序列100條，發(fā)現(xiàn)這些序列可以分為6大門類（圖2）：Proteobacteria（變形菌門）42%，其中Alphaproteobacteria（α-變形菌綱）21%、Betaproteobacteria（β-變形菌綱）6%、Gammaproteobacteria（γ-變形菌綱）15%，另外Clostridia（梭狀芽胞桿菌綱）4%。Planctomycetes（浮霉菌門）5%、Actinobacteria（放線菌門）與Firmicutes（厚壁菌門）4%、Acidobacteria（酸桿菌門）12%、以及未知細菌37%左右。

3? 討論

環(huán)境中微生物的群落組成信息能反映出環(huán)境的特點，不同的細菌群落結(jié)構(gòu)體現(xiàn)出他們特殊的生態(tài)功能。本研究對富灣銀礦的研究結(jié)果進行了分析，把土壤細菌類群的多樣性及各個類群所占的豐富度做了比較，發(fā)現(xiàn)Proteobacteria（變形菌門）是細菌中最大且多樣性比較豐富的一個門，這與在云南省瀾滄縣募乃鉛鋅礦區(qū)尾礦中的研究結(jié)果一致[6]。有研究表明，變形菌是一種富營養(yǎng)菌，與土壤的養(yǎng)分呈正相關(guān)性[7]。因而變形菌更容易分解利用有機物，大量繁殖，形成優(yōu)勢菌種。在富灣銀礦的土壤樣品中發(fā)現(xiàn)α-變形菌優(yōu)勢菌群，占了21%，α-變形菌屬于兼性厭氧光能營養(yǎng)型細菌[8]，是能廣泛適應自然環(huán)境的菌種，具有適應生境的生理特性，特別是能在厭氧條件下反硝化脫氮，在水體、底泥、土壤等多種生境下存活。富灣銀礦只是開采了一小部分，后被被制止開采，可能土壤的有機含量還是比較高，有半纖維素和蛋白質(zhì)等簡單有機物。本研究也發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱在微生物群落里也是屬于主要的細菌類群，分析其原因是γ-變形桿菌適應能力強，在廣泛分布于各種環(huán)境中;此外還存在有β-變形菌及伯克氏菌，β-變形菌也是厭氧異養(yǎng)型且能進行光合作用的細菌。據(jù)研究表明該菌群可降解烴類等，在比較缺乏氮的環(huán)境中具有固定氮[9]的作用，而且在高濃度的硝酸鹽環(huán)境下具有反硝化能力，因而能夠忍受高堿高鹽的環(huán)境[10]。由此可以看出在環(huán)境惡劣礦區(qū)環(huán)境中，能夠進行光合作用且能無機化能為自身細胞提供能量的細菌可以生活在礦區(qū)。