淫羊藿苷對兔股骨MEG3、H19和DANCR表達的影響

張傳志 周庾 胡曉波 劉莉

重慶市中醫院(重慶市第一人民醫院)骨二科,重慶 400100

絕經后骨質疏松癥是由雌激素水平下降引起的一種全身性骨代謝疾病，其發病率在老年婦女中高達52%[1]。 既往研究[2]表明，mRNA在細胞增殖、分化、分裂、凋亡和信號轉導過程中起著重要作用，并參與了多種疾病的發生和發展。而最近的研究[3-4]證實，各種長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)如母系表達基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)，可通過調控轉錄、轉錄后以及表觀遺傳學水平來參與疾病的發生，是一種重要的調節因子。越來越多的證據[4-5]表明MEG3在調控骨髓間充質干細胞的分化過程中起著重要作用。MEG3與BMSC的異常分化誘導密切相關，但是MEG3與絕經后骨質疏松癥的關系尚未見報道。研究發現[6-7]長鏈非編碼RNA H19、DANCR可調節成骨細胞的增殖和分化。三種長鏈非編碼RNA已在體外實驗中被證明了其對成骨細胞的調節作用，但在體內的影響還未開展相關研究。淫羊藿苷是從天然植物中提取的黃酮類藥物，已被證明有促進成骨與抑制破骨的雙重作用。本研究旨在通過淫羊藿苷干預骨質疏松新西蘭白兔，檢測其不同部位骨的長鏈非編碼RNA MEG3/H19/DANCR的表達情況，同時研究其對股骨顯微結構變化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1建立OVX模型：選取未生育的7月齡健康成年新西蘭白兔48只，體重(1.6±0.29)kg。在10天的適應期后，根據體重隨機分為假手術組、去卵巢模型組(OVX)和淫羊藿苷治療組(OVX加治療)。 假手術組實施手術切除雙側卵巢周圍脂肪一塊；去卵巢模型組與淫羊藿苷治療組在使用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對腹腔進行注射全麻后，行雙側卵巢切除術，雙側切口長約3～4 cm。術后每天觀察動物的切口直至愈合。

1.1.2淫羊藿苷給藥：行雙側卵巢切除術后4周，淫羊藿苷治療組給予淫羊藿苷[20 mg/(kg·d)]灌胃[8]，去卵巢模型組與假手術組每天給予等量的生理鹽水灌胃，持續8周。術后12周，對實驗動物實施安樂死后取其雙側的股骨與腰椎(L5)備用。

1.2 方法

1.2.1Micro-CT分析骨質疏松模型的建立：用70%的乙醇對取得的新西蘭白兔股骨進行固定。24 h后對股骨頭進行micro-CT(SkyScan 1072)掃描，使用相關分析軟件(SkyScan，Belgium)進行分析，圖像采集時所選擇的電壓和電流為100 kV、98 mA，將樣本密封在緊密的塑料包里以避免在掃描過程中出現移動或樣品出現脫水。對圖像進行閾值分割以從背景圖像中分割出骨的圖像。通過配套的3D軟件將2D圖像通過3D渲染獲得3D模型。微CT圖像分辨率為18.2 μm。再根據三維圖像對標本的骨參數進行分析，具體包括：骨體積/總體積(BV/TV)，骨表面積/骨體積(BS/BV)，骨小梁的分離度Tb·Sp，骨小梁的厚度Tb·Th，骨小梁的數量(Tb·N)。

1.2.2qRT-PCR檢測：在骨質疏松模型建立的第12周時通過qRT-PCR檢測兩組股骨、椎骨組織中長鏈非編碼RNA MEG3、H19、DANCR的表達水平以及Runx2的mRNA表達水平。根據試劑盒說明書用Trizol提取細胞的總RNA(Invitrogen)。實驗設6個復孔，通過紫外分光光度計測定總RNA濃度。總RNA的反轉錄遵循反轉錄試劑盒(Thermo)操作說明，PCR的擴增使用實時定量PCR的預混合溶液SYBR Green qPCR Master Mix(Thermo)，擴增之后的MEG和Runx2的相對表達分析以GAPDH 作為內源參照基因，引物由上海生工合成，具體見表1。獨立的實驗重復3次以減少誤差，結果的計算采用2-ΔΔCt法。

表1 qRT-PCR中應用的引物序列Table 1 The primer sequences for qRT-PCR

1.2.3免疫組化檢測BMP2：采用S-P法，假手術組和去卵巢模型組一抗用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替,其余各步均同淫羊藿苷治療組，步驟如下：①切片脫蠟入水：將切片分別浸泡于二甲苯液中30 min、無水酒精中5 min、95 %酒精中5 min、75 %酒精中5 min，用蒸餾水清洗2次，在PBS(pH=7.4)中浸泡5 min；②內源性過氧化物酶阻斷：滴加A液50 μL于切片上，室溫孵育10 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；③抗原修復：切片浸泡于0.1 mol/L EDTA修復液中,加溫至99 ℃并保持10 min，任其自然冷卻至室溫，在PBS中浸泡5 min(3次)；④非免疫血清封閉：滴加B液50 μL于切片上，室溫孵育10 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑤滴加一抗：淫羊藿苷治療組滴加鼠抗兔抗體，假手術組和去卵巢模型組使用PBS代替，室溫下孵育60 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑥滴加二抗：滴加羊抗鼠抗體液于切片上，室溫孵育10 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑦滴加抗生物-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑧滴加過氧化物酶底物，顯微鏡下觀察6 min，當部分切片出現較強的棕黃色產物時，用PBS終止顯色反應，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑨用蒸餾水沖洗，在鹽酸中浸泡2 s后再用蒸餾水沖洗；⑩脫水、封片：在95 %酒精中浸泡5 min，在無水酒精中浸泡10 min，烘干，鏡下觀察，顯微攝影。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 顯微CT分析骨質疏松模型的建立

由表2、圖1可見，骨質疏松模型建立成功。與去卵巢模型組相比，經淫羊藿苷干預后，骨質疏松兔股骨頭的BV/TV升高了41.86 %(P<0.01)、Tb·Th升高34.78 %(P<0.05)、Tb·N升高41.05 %(P<0.01)，BS/BV降低30.76 %(P<0.05)，Tb·Sp降低36.58 %(P<0.05)。

表2 顯微CT對股骨頭的顯微結構分析結果Table 2 Results of microct analysis of

注：與去卵巢模型組比較，**P<0.01；與去卵巢模型組比較，*P<0.05。

圖1 股骨3D圖像Fig.1 3D image of femur

2.2 不同部位骨的長鏈非編碼RNA MEG3/H19/DANCR的表達情況

表3所示，淫羊藿苷治療組股骨中MEG3、H19、DANCR的表達與去卵巢模型組相比明顯升高，分別升高38.1 %(P<0.01)、44.9 %(P<0.01)、49.15 %(P<0.01)，椎骨中H19、DANCR的表達與去卵巢模型組相比無明顯變化(P>0.05)，MEG3的表達與去卵巢模型組相比升高64 %(P<0.01)。顱骨中MEG3、H19的表達與去卵巢模型組相比無明顯變化(P>0.05)，然而DANCR的表達與去卵巢模型組相比升高了31.25 %(P<0.05)。股骨、椎骨(L5)、顱骨中Runx2與去卵巢模型組相比分別升高32.97 %(P<0.05)、29.79 %(P<0.05)、29.41 %(P<0.05)。

表3不同部位骨中lncRNA MEG3/H19/DANCR的表達

Table3Expression of lncRNA MEG3/H19/DANCR in different bones

基因 假手術組去卵巢模型組淫羊藿苷治療組股骨MEG31.05±0.090.63±0.08??0.87±0.11??lnc-H191.31±0.070.49±0.040.71±0.06??DANCR1.14±0.080.59±0.05??0.88±0.09??Runx21.58±0.080.91±0.16?1.21±0.14?椎骨MEG30.49±0.050.25±0.07??0.41±0.4??lnc-H190.99±0.110.87±0.090.93±0.12DANCR0.84±0.050.83±0.120.97±0.1Runx20.86±0.140.47±0.13?0.61±0.12?顱骨MEG30.29±0.090.31±0.080.27±0.11lnc-H190.58±0.080.51±0.070.46±0.06DANCR0.35±0.050.16±0.02?0.21±0.03?Runx20.63±0.090.34±0.04??0.44±0.09?

注：與去卵巢模型組比較，**P<0.01；與去卵巢模型組比較，*P<0.05。

2.3 免疫組化檢測股骨頸中BMP2的表達

由圖2可知，三組免疫組化結果中，淫羊藿苷治療組胞漿、核周或細胞外基質的棕黃色顆粒狀染色最多，說明淫羊藿苷治療組股骨頸中的BMP2表達最高，其次為假手術組，去卵巢模型組股骨頸中的BMP2表達最低。

圖2 免疫組化檢測股骨頸中BMP2的表達Fig.2 Immunohistochemical detection of BMP2 expression in the neck of femur

3 討論

淫羊藿苷是淫羊藿中含量最豐富的一種黃酮類成分，具有良好的骨再生和修復作用[9]。越來越多的證據[10]表明淫羊藿苷可通過刺激骨形成同時抑制骨吸收而在骨轉化的平衡中發揮雙重作用，因此天然植物中提取的淫羊藿苷成為了防治骨質疏松癥的一種具有潛力的替代品。重要的是，作為一種結構穩定的藥物，它可以加載在生物材料上進成局部的釋放，形成局部的骨誘導[11-12]。最新的證據[13]表明，lncRNA是一種長度≥200個核糖核酸的非編碼RNA，它在多種生物學過程(如轉錄調控、細胞生長和腫瘤發生)中起著重要作用。既往研究關注于骨質疏松治療藥物對mRNA的影響，然而越來越多的證據[14-15]表明MEG 3對骨髓間充質干細胞的分化具有調控作用。研究發現[16]，絕經期后MEG 3和miR-133a-3p的表達在骨髓間充質干細胞中的表達呈正相關，長鏈非編碼MEG3通過靶向調控miR-133a-3p的表達從而抑制絕經后骨質疏松癥骨髓間充質干細胞的成骨分化。長鏈非編碼RNA H19僅從母系遺傳等位基因轉錄，不編碼蛋白質，H19在進化過程中高度保守以及外顯子的突變率很低的特點使其具有重要的生物學功能，同時，H19已被證明是成骨細胞增殖和分化的關鍵調節因子之一[6,17]，因此筆者推測H19可能與骨相關疾病有關。研究還發現DANCR可通過誘導的IL-6和TNF-α促進骨的吸收，可以作為絕經后骨質疏松癥的生物標志物[7]。此外，DANCR還可調節成骨細胞的分化，是成骨細胞分化的重要介質[18]。因此本次研究把焦點放在這3個長鏈非編碼RNA上，探討了淫羊藿苷對這3種非編碼RNA在骨質疏松兔股骨、腰椎(L5)、顱骨上表達的影響。筆者在淫羊藿苷干預骨質疏松模型中發現淫羊藿苷干預后股骨中H19的RNA表達上調，與之前的研究一致[19]。

研究表明，RUNX 2是成骨細胞生長的關鍵性因子，在對821名西班牙絕經期婦女的研究中[20]發現，RUNX2與腰椎和股骨頸的骨密度有關。此次研究通過PCR檢測發現淫羊藿苷干預骨質疏松兔模型的RUNX2。BMP 2(骨形態發生蛋白-2)通過促進間充質細胞分化為成骨細胞，從而促進骨形成與修復；此次研究的免疫組化結果顯示，經淫羊藿苷治療后的BMP2在股骨頸中表達最高。本次研究中證明淫羊藿苷對骨質疏松兔的模型有明顯效果，與之前的研究[9]一致，外源性的淫羊藿苷對骨質疏松的作用表現在使脛骨的骨小梁增加。有意思的是，淫羊藿苷對長鏈非編碼RNA(MEG3、H19、DANCR)的影響主要表現在股骨，對椎骨、顱骨的影響分別表現在MEG3和DANCR的影響，淫羊藿苷可通過促進股骨的MEG3、H19、DANCR的表達來促進骨質疏松的治療。

綜上，股骨中3個lncRNA(MEG3、H19、DANCR)的表達與成骨基因RUNX2和BMP2表達上調有關。由于本次研究具有局限性，未來的研究可以進一步驗證不同骨中lncRNA(MEG3、H19、DANCR等)的表達與成骨基因RUNX2和BMP2的關系，以及淫羊藿苷影響骨質疏松具體的信號轉導機制。