氟化鈉對(duì)骨組織主要細(xì)胞類型的影響

蔣寧寧 郭奉楊 史立群 徐輝

1.吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130021 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂倫春自治旗阿里河社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，內(nèi)蒙古 鄂倫春165450

骨質(zhì)疏松是一種以骨量低為特點(diǎn)的代謝性骨病變，而骨量的減少與骨重建過(guò)程聯(lián)系緊密[1]。在骨重建過(guò)程中，成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞分別負(fù)責(zé)骨形成和骨吸收，來(lái)穩(wěn)定骨骼的結(jié)構(gòu)[2]。骨細(xì)胞通過(guò)響應(yīng)機(jī)械應(yīng)力發(fā)送的信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)骨吸收或骨形成，在骨重建的作用是其主要功能。眾多研究發(fā)現(xiàn)，氟化物對(duì)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的分化起著重要作用[3-4]，成骨細(xì)胞的增殖速率決定著骨形成速率，破骨細(xì)胞的數(shù)量及活性決定了骨吸收速率，二者的動(dòng)態(tài)平衡決定骨代謝的平衡[5]。研究證明，氟化物過(guò)量可引起骨組織細(xì)胞和骨基質(zhì)的礦化缺陷，導(dǎo)致骨代謝平衡失調(diào)，引發(fā)骨質(zhì)疏松等全身性的骨骼疾病[6-7]。迄今為止，不同劑量氟對(duì)骨細(xì)胞活性影響的研究報(bào)道很少，尤其是平行研究不同氟濃度下骨組織中3種主要細(xì)胞的活性變化還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究探究不同氟濃度對(duì)3種細(xì)胞活性的影響，分析3種細(xì)胞染氟時(shí)間不同細(xì)胞活性的變化情況，進(jìn)而為研究氟骨癥中的骨代謝提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 3種細(xì)胞的來(lái)源及誘導(dǎo)培養(yǎng)

1.1.1小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)分離和培養(yǎng)：6～8周齡的ICR小鼠購(gòu)自吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將小鼠麻醉、脫頸處死后投入裝有75%乙醇的燒杯內(nèi)消毒1～3 min。無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨，去除骨膜及周圍組織，用無(wú)菌PBS反復(fù)沖洗骨髓腔，直到骨髓腔發(fā)白為止，收集沖洗下的細(xì)胞懸液1 200 r/min，離心5 min。將沉淀的細(xì)胞重懸，種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后更換培養(yǎng)液，漂洗去除未貼壁細(xì)胞。將細(xì)胞傳至第3代，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原CD34和CD44表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)占94.6%，確認(rèn)培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。BMSCs用10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、40 ng/mL地塞米松進(jìn)行礦化誘導(dǎo)，使其成為成骨細(xì)胞。而成骨細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)4 d后才能進(jìn)入分化狀態(tài)，所以待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期以2×104個(gè)/mL的密度接種于3個(gè)96孔板，待細(xì)胞均貼壁后，按照空白對(duì)照、低氟濃度(0.1、0.5、1、2 mg/L)、中氟濃度(4、8 mg/L)、高氟濃度(16、32 mg/L)8個(gè)濃度染氟，在細(xì)胞培養(yǎng)1、2、4 d后在570 nm波長(zhǎng)下使用賽默飛世爾Multiskan FC酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.1.2小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7：RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。將RAW264.7細(xì)胞接種于含5%胎牛血清及1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液中，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期以2×104個(gè)/mL的密度接種于3個(gè)96孔板，待細(xì)胞均貼壁后用25 ng/mL RANKL誘導(dǎo)3～5 d使其成為破骨細(xì)胞。分別加入不同濃度F-濃度(與上同)，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)1、2、4 d后在570 nm波長(zhǎng)使用賽默飛世爾Multiskan FC酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.1.3骨細(xì)胞系IDG-SW3：IDG-SW3細(xì)胞由Indiana大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Lynda F.Bonewald教授贈(zèng)與。將IDG-SW3細(xì)胞接種在鋪有膠原基質(zhì)的培養(yǎng)瓶里，并在含有4 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL維生素C的α-MEM培養(yǎng)液中進(jìn)行礦化誘導(dǎo)，使其表達(dá)骨細(xì)胞標(biāo)志硬化蛋白后，確認(rèn)成為骨細(xì)胞。骨細(xì)胞作為成骨細(xì)胞的終末成熟細(xì)胞，在1～4 d觀察該種細(xì)胞的代謝改變。將細(xì)胞以2×104個(gè)/mL的密度接種于3個(gè)96孔板，待細(xì)胞均貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組分別加入F-至終氟濃度(與上同)，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)1、2、4 d后在570 nm波長(zhǎng)下使用賽默飛世爾Multiskan FC酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.2 試劑與儀器

α-MEM、DMEM、PBS(Hyclone公司，美國(guó))，胎牛血清(天杭生物科技股份有限公司，中國(guó))，β-甘油磷酸鈉、維生素C、Collagen Type I Rat Tail、MTT、氟化鈉(Sigma-Aldrich，美國(guó))，二甲基亞砜DMSO(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，中國(guó))，酶標(biāo)儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司，型號(hào) Multiskan FC)。

1.3 MTT法檢測(cè)不同氟濃度對(duì)3種不同的細(xì)胞活性

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，PBS洗3次去除細(xì)胞分化誘導(dǎo)液，待測(cè)孔每孔加入180 μL的DMEM和20 μL的 5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h后小心吸出培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值，重復(fù)3次檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

如表1所示，3種細(xì)胞給予不同氟化物濃度處理1 d后，與對(duì)照組相比，高氟濃度對(duì)3種細(xì)胞均有抑制作用，其中32 mg/L組較16 mg/L組抑制作用更為顯著。當(dāng)3種細(xì)胞暴露于32 mg/L時(shí)，與對(duì)照組相比，骨細(xì)胞活性下降了22.6%，而破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性分別下降了94.1%和94.6%，呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。由此可以看出，高氟濃度16 mg/L、32 mg/L對(duì)3種細(xì)胞有顯著的毒性抑制作用。

組別 IDG-SW3 cellsRAW264.7 cellsBMSCs cells空白對(duì)照0.354±0.0300.443±0.0790.444±0.0570.1 mg/L0.371±0.0180.410±0.0930.385±0.0720.5 mg/L0.347±0.0190.408±0.0430.446±0.1111 mg/L0.327±0.0300.431±0.0990.426±0.0292 mg/L0.329±0.0220.442±0.0550.421±0.0854 mg/L0.341±0.0220.423±0.0820.477±0.1788 mg/L0.340±0.0250.417±0.0600.392±0.073??16 mg/L0.338±0.0220.224±0.052??0.171±0.059??32 mg/L0.274±0.016??0.026±0.010??0.025±0.010??

注：與對(duì)照組相比較，**P<0.01。

隨著投氟時(shí)間增加到2 d，如表2所示，低氟濃度提高骨細(xì)胞活性，尤其是0.5 mg/L和1 mg/L促進(jìn)作用明顯。與對(duì)照組相比，細(xì)胞活性均增加了8%。中氟濃度8 mg/L抑制破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活性，細(xì)胞活性分別下降了26.7%和29.7%。而高氟濃度16 mg/L和32 mg/L對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性的抑制作用更加明顯，就16 mg/L而言，兩種細(xì)胞活性均下降了91.7%，而骨細(xì)胞活性則下降了5.3%。結(jié)果說(shuō)明骨細(xì)胞對(duì)高劑量的氟耐受力明顯比破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞強(qiáng)。

組別IDG-SW3 cellsRAW264.7 cellsBMSCs cells空白對(duì)照0.547±0.0380.833±0.0950.496±0.0590.1 mg/L0.579±0.0250.832±0.1100.490±0.0400.5 mg/L0.591±0.037?0.776±0.1170.531±0.0621 mg/L0.591±0.039?0.801±0.1000.502±0.0972 mg/L0.528±0.0340.772±0.0680.492±0.0834 mg/L0.539±0.0380.756±0.0780.462±0.0768 mg/L0.560±0.0210.611±0.111??0.299±0.073??16 mg/L0.518±0.0250.069±0.020??0.041±0.022??32 mg/L0.240±0.030??0.017±0.002??0.011±0.003??

注：與對(duì)照組相比較，*P<0.05，**P<0.01。

投氟時(shí)間增加到4 d時(shí)，如表3所示，低氟濃度對(duì)骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性促進(jìn)作用較明顯，當(dāng)這兩種細(xì)胞暴露于0.1 mg/L時(shí)，與對(duì)照組相比，骨細(xì)胞活性增加了8.8%，破骨細(xì)胞活性增加了16%。骨細(xì)胞的活性在0.1～2 mg/L氟處理下顯著增高，1～4 mg/L氟處理下的破骨細(xì)胞的活性也明顯比對(duì)照組高。然而，成骨細(xì)胞只有在0.1 mg/L和0.5 mg/L作用下細(xì)胞活性輕度提高了，隨著氟濃度增加成骨細(xì)胞活性也隨之下降。當(dāng)3種細(xì)胞暴露于16 mg/L 4 d后，與對(duì)照組相比，骨細(xì)胞活性下降了8.6%，而破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性則分別下降了90.8%和97.2%。3種細(xì)胞染氟4 d的活性充分顯示了低劑量氟對(duì)破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的刺激作用，而高劑量氟對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的顯著抑制作用。

組別IDG-SW3 cellsRAW264.7 cellsBMSCs cells空白對(duì)照0.697±0.0450.655±0.1220.643±0.0810.1 mg/L0.758±0.036?0.760±0.1420.693±0.0840.5 mg/L0.740±0.029?0.662±0.1030.653±0.0811 mg/L0.700±0.0460.845±0.085?0.552±0.0922 mg/L0.630±0.048?0.796±0.117?0.592±0.0734 mg/L0.649±0.0630.807±0.121?0.591±0.1008 mg/L0.700±0.0350.611±0.0430.295±0.124??16 mg/L0.637±0.054?0.060±0.009??0.018±0.005??32 mg/L0.085±0.036??0.007±0.003??0.012±0.005??

注：與對(duì)照組相比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

氟骨癥是指長(zhǎng)期攝入過(guò)量氟化物引起氟中毒的一種慢性侵襲的全身性骨病。在氟骨癥發(fā)病過(guò)程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的活躍[8]，成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)/破骨細(xì)胞活性減弱可能是骨硬化發(fā)生的原因。方瑤瑤等[9]發(fā)現(xiàn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，有利于骨形成。在本實(shí)驗(yàn)中，低濃度增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的活性，成骨細(xì)胞在0.1 mg/L濃度下暴露4 d后，細(xì)胞活性提高了7.8%，提示了長(zhǎng)期小劑量的氟可以刺激成骨細(xì)胞活性[10]。高氟濃度降低了BMSCs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞活性和破骨細(xì)胞活性，從而證明了大劑量的氟能夠?qū)е鹿琴|(zhì)疏松或骨硬化[10]。通過(guò)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性可以預(yù)測(cè)骨丟失情況，本研究旨在分析3種細(xì)胞染氟后的活性變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氟化物對(duì)所有類型的細(xì)胞都有負(fù)面影響，但破骨細(xì)胞對(duì)低劑量和高劑量氟化物作用敏感。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究人員報(bào)告了氟化物對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性影響[3]，進(jìn)而研究?jī)煞N細(xì)胞在骨代謝過(guò)程中的作用，但骨細(xì)胞在氟中毒中的作用研究較少。本研究采用IDG-SW3細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)使其分化為骨細(xì)胞，采用MTT法分析骨細(xì)胞的活性。研究數(shù)據(jù)表明，低劑量的氟提高骨細(xì)胞活性，氟暴露于0.5 mg/L濃度下2 d和4 d后細(xì)胞活性均有顯著性。中劑量中8 mg/L氟化物處理僅提高了骨細(xì)胞的活性，對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性表現(xiàn)出抑制作用，高劑量中16 mg/L的氟化物使骨細(xì)胞活性下降了不到10%，但幾乎抑制了90%以上的破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，這表明骨細(xì)胞不僅可以對(duì)低量氟刺激作用敏感，而且累積氟毒性具有很強(qiáng)的耐受性。

綜上所述，本研究通過(guò)骨組織中3種主要類型細(xì)胞染氟實(shí)驗(yàn)研究，驗(yàn)證了氟化物對(duì)3種細(xì)胞活性的雙重作用，即低氟濃度對(duì)破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的促進(jìn)作用，高濃度氟對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的抑制作用。綜合3種細(xì)胞活性來(lái)看，氟對(duì)成骨細(xì)胞的刺激作用范圍最窄，而抑制作用顯著，破骨細(xì)胞對(duì)氟劑量的變化最敏感，而骨細(xì)胞對(duì)氟化物蓄積毒性的耐受性最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究慢性氟骨癥骨病變提供了重要線索和依據(jù)。