銀杏葉提取物對慢性阻塞性肺疾病大鼠血清及肺組織中CRP、IL-1及IL-8的影響

王明娟，齊永奇

(1.河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450008；2.華北水利水電大學，河南 鄭州 450045)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以不完全可逆性氣流受限為主要特征，累及氣道、肺實質及肺血管的一種常見慢性疾病[1]，目前其發病機制和致病機理尚不完全明確。普遍認為COPD是由個體疾病易獲得因素和外界因素共同造成的，隨著吸煙人數的增多和空氣污染的加劇，該病癥發病率和病死率日趨上升，對社會經濟造成巨大壓力，已經成為全球性的公共衛生問題[2]。COPD的病情發展比較迅速，可逐漸發展為肺心病、心力衰竭、呼吸衰竭等，救治不及時甚或危及生命。當前研究成果認為,COPD的發生涉及炎性反應、氧化損傷、蛋白酶-抗蛋白酶失調、免疫功能障礙等多個方面[3]。銀杏是中醫傳統藥物，具有悠久的使用歷史，《本草綱目》中記載其有“定喘止咳”之功效。銀杏葉提取物(GinkgobilobaExtract，GBE)是從銀杏的干燥葉中提取的有效藥用組分，主要包括黃酮類、萜類內酯、有機酸、氨基酸、微量元素等多種化學成分。研究證實，GBE能抑制肺氣腫的形成及肺血管重塑，不僅可以增強正常機體的免疫功能，還可調節異常機體的免疫功能[4]。本次研究就GBE對COPD大鼠道炎癥的病理學改變及血清及肺組織中CRP、IL-1、IL-8的影響展開觀察，探討其對COPD大鼠氣道和全身炎癥的干預作用，為臨床治療提供實驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MasterScreen PFT System肺功能儀(德國耶格公司)；自制有機玻璃熏煙箱(80 cm×40 cm×50 cm)；新津事豐一次性無菌注射器(成都市新津事豐醫療器械有限公司)；PL2000PLUS血氣生化分析儀(北京普朗醫療)；BL-420S生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)；HX200呼吸流量換能器(上海益聯醫學儀器發展有限公司)；CUT6062石蠟切片機(德國SLEE公司)。

1.2 藥品與試劑

舒血寧注射液(山西太原藥業有限公司，國藥準字:Z14021962，每支5 mL，折合GBE為175 mg，含總黃酮醇苷42 mg、銀杏內酯70 mg)；“紅雙喜”牌香煙(上海煙草集團有限責任公司)；脂多糖(Sigma-L2880，美國Sigma公司)；注射用乳糖酸紅霉素(廣西梧州制藥(集團)股份有限公司，國藥準字:H45021339)；CRP、IL-1、IL-8 檢測試劑盒(美國R&D公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組方法

健康清潔級SD大鼠60只，體質量(210±20)g，由省動物實驗中心提供。所有大鼠分籠飼養，由專人負責管理。實驗室定期消毒，環境溫度20 ℃～25 ℃，相對濕度50%～70%。飼養1周后開始實驗。所有大鼠稱重后隨機分為A、B、C、D共4組，每組各15只。A組15只大鼠為正常對照組，B、C、D組共45只大鼠通過香煙熏吸加氣道內注入脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)方法建立大鼠COPD模型，B組為COPD對照組，C組為GBE干預組，D組為紅霉素干預組。

1.3.2 COPD模型建立方法

所有COPD大鼠模型均由香煙熏吸聯合氣道內注入脂多糖的方法進行造模[5]。香煙熏吸：上午在自制有機玻璃熏煙箱內給予4根香煙熏吸，每次時間為30 min，結束后將大鼠轉移至實驗室正常環境內飼養。脂多糖氣管注入：于實驗第1天和第14天使用10%水合氯醛，按照100 g/0.25 mL的劑量腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定于固定板上，暴露聲門，靜脈套管針插入氣道，快速注入100 μL LPS(1 mg/mL)，直立固定板并旋轉，盡可能的使LPS充分均勻的分布于大鼠兩肺。造模共28 d，A 組于第 1 天和第 14 天氣管內注入2 mL/kg生理鹽水，B、C、D組除第1天和第14天LPS氣管注入外，其余時間均進行香煙熏吸。28 d后對大鼠肺功能進行檢測：分別將三通管和呼吸流量換能器連接在Y型氣管插管的兩端，首先記錄一段平靜呼吸曲線，然后在呼吸末使用注射器在三通管段內快速注入6 mL空氣，立即脫開后自然呼出，使用BL-420S生物機能實驗系統記錄呼吸曲線并計算0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)及大鼠FEV0.3占用力肺活量百分比(FEV0.3/FVC)。B、C、D組各取兩只大鼠處死，迅速取出完成肺組織，生理鹽水沖洗干凈后將肺部組織放入10%的福爾馬林液中固定24 h后,乙醇及正丁醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。使用光學顯微鏡下觀察肺組織改變，若出現肺泡壁變薄、斷裂，肺組織結構破壞，支氣管黏膜變性、壞死，伴有炎性細胞浸潤，或肺氣腫病理改變等符合COPD表現，結合肺功能下降即可說明COPD造模成功。

1.3.3 給藥方法

所有大鼠均為腹腔注射給藥，A、B組給予生理鹽水0.4mL/(kg·d)，C組給予GBE 0.4 mL/(kg·d)，D組根據體表面積換算方法為100 mg/kg2給予紅霉素。所有療程均為2周。

1.3.4 肺泡灌洗方法

使用10%水合氯醛將大鼠麻醉，器官插管，四肢固定于固定板，打開胸腔，充分暴露肺部，結扎左側肺門。分離大鼠頸部氣管，并在氣管下端橫切一小切口，緩慢插入氣管插管。若有輕微阻滯的感覺則表明氣管插管達到隆突部位，需要略微旋轉退回一部分插管，結扎完成插管。將事先備好的5 mL注射器吸取2 mL生理鹽水緩慢注入大鼠右肺進行灌洗，在適宜的時機緩慢抽回灌洗液，再將抽回的灌洗液緩慢注入，重復3次直到帶有泡沫的微混液體流出表示1次灌洗成功。

1.4 觀察指標

1)血清CRP、IL-1、IL-8：治療完成后抽取動脈血1 mL，靜置30 min后離心分離血清，采用酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)檢測CRP、IL-1、IL-8含量，所有步驟均嚴格按照試劑盒操作流程。2)肺組織CRP、IL-1、IL-8：治療完成后按照上述肺泡灌洗方法灌洗大鼠肺部，重復灌洗3次，每次回收灌洗液1.5 mL，共回收所需的4.5 mL肺支氣管肺泡灌洗液(BALF)置于離心管，震蕩5 min，靜置12 h后離心分離取上相液后待檢，采用ELISA檢測CRP、IL-1、IL-8含量。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 血清和肺組織CRP水平比較

B、C、D組血清和肺組織CRP水平均明顯高于A組(P<0.05)；C、D組血清和肺組織CRP水平相較B組有明顯降低(P<0.05)，其中C、D組兩組相較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 血清和肺組織IL-1水平比較

B、C、D組血清和肺組織IL-1水平均明顯高于A組(P<0.05)；C、D組血清和肺組織IL-1水平相較B組有明顯降低(P<0.05)，其中C、D組兩組相較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

組別例數血清BALFA組131.10±0.32b1.98±0.21bB組132.97±0.48a2.99±0.27aC組131.47±0.35abc2.27±0.24abcD組131.56±0.46ab2.31±0.21abF52.57743.502P<0.001<0.001

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與D組比較，cP>0.05。

組別例數血清BALFA組1364.52±25.31b38.91±15.28bB組13118.73±50.62a74.65±30.31aC組1368.53±28.75abc39.51±16.37abcD組1371.62±27.46abc41.25±18.20abcF7.0248.998P0.001<0.001

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與D組比較，cP>0.05。

2.3 血清和肺組織IL-8水平比較

B、C、D組血清和肺組織IL-8水平均明顯高于A組(P<0.05)；C、D組血清和肺組織IL-8水平相較B組有明顯降低(P<0.05)，其中C、D組兩組相較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

組別例數血清BALFA組1375.60±12.35b41.28±8.93bB組13173.62±35.82a65.78±15.67aC組1383.61±15.26abc43.35±9.35abcD組1382.37±16.03abc44.61±10.31abcF58.84813.096P<0.001<0.001

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與D組比較，cP>0.05。

3 討論

COPD是臨床常見疾病，具有發病率高、復發率高、死亡率高“三高”的特點，其主要表現為氣流受限、肺功能下降，對患者的生活質量造成嚴重影響，同時也帶來巨大的經濟和精神負擔。隨著環境的不斷惡化和吸煙人群的不斷上升，COPD的發病率呈現明顯的上升趨勢。積極探索COPD病理和發病機制，研究有效的輔助治療藥物提高該病的臨床治療效果和預后十分必要。COPD是一種可預防和治療的疾病，但目前未證實有藥物能夠顯著改善患者肺功能長期下降的趨勢，對于COPD急性發作的患者，其治療目標是盡可能的降低急性發作對患者造成的影響并預防再次急性發作。研究證實，COPD的發病機制主要包括炎癥反應、氧化應激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡及細胞凋亡等多個方面[6]。炎癥介質和細胞因子在COPD的發生和發展中起到重要作用，故而抑制炎癥反應是COPD治療中的重要環節。COPD患者體內血液處于高凝狀態，長期血液高凝狀態極易形成微血栓，加速COPD的進展。因此在常規治療的基礎上配合抗凝、抗感染等綜合治療措施具有非常明顯的作用。近年來研究發現，GBE對改善血液高凝狀態、降低肺動脈壓及肺血管阻力具有明顯的作用[7]，但其在呼吸系統疾病中的研究不多見，故而本次實驗通過觀察GBE對COPD大鼠血清和肺組織炎性介質的影響，探討其可能的作用機制，為COPD的治療和預防提供實驗依據。

吸煙、環境暴露和有機粉塵是COPD的主要致病因素[8]。鑒于此，本次研究采用香煙熏吸聯合氣道內注入脂多糖的方法造模。結果顯示該方法可導致與COPD 相同的病理生理學改變。COPD患者氣道管腔及管壁內存在大量的炎癥細胞，有研究發現其水平與COPD癥狀嚴重程度呈一定的正相關性[9]。CRP是臨床上最常用的炎癥反應標志物之一，其具有激活補體，促進炎癥吸收等功能[10]，對COPD慢性炎癥的敏感度很高。當機體發生炎癥反應、組織損傷、惡性腫瘤時，CRP水平顯著升高，其血清濃度上升速度與炎癥反應的范圍及程度具有正相關性。血清CRP水平可以反應COPD患者氣道炎癥程度，持續高水平的CRP會及你不造成氣道上皮功能的損傷，影響患者肺功能。IL-1一般存在于血液和組織中，主要有單核巨噬細胞產生，分為IL-1α和IL-1β兩型。IL-8也由單核巨噬細胞產生，能夠促使中性細胞粒活化、遷移、釋放炎性介質，直接對組織產生損害。因IL-11β能夠激發靶細胞內NF-кB信號通路，誘導IL-8的釋放[11]，可將IL-1β和IL-8納入同一反應鏈中。IL-1和IL-8在COPD病情的發展中發揮著重要的作用。本次研究顯示，B組(COPD對照組)大鼠血清和肺組織中CRP、IL-1、IL-8均明顯高于A組(正常對照組)，與其他學者研究結果基本一致[12]。紅霉素能夠減輕COPD患者氣道炎癥反應已成為普遍認識，因此本次研究以紅霉素作為干預對照組與GBE組的干預效果形成對照。本次研究結果顯示，C組(GBE干預組)和D組(紅霉素干預組)大鼠血清和肺組織中CRP、IL-1、IL-8均比B組有明顯的降低(P<0.05)，且C組和D組差異無統計學意義(P>0.05),表明GBE與紅霉素干預效果相當，能夠有效抑制COPD氣道及全身炎癥反應，進一步證明了GBE對COPD的輔助治療作用。

GBE主要由黃酮類、萜類內酯化合物等組成，其中銀杏內脂是其中最重要的成分。血小板活化因子會導致炎癥細胞向氣道遷移、活化并釋放炎性介質和細胞因子，同時釋放的炎性介質和細胞因子又能夠增加血小板活化因子的合成[12]。因此抑制血小板活化因子的合成是治療的重要部分。銀杏內脂具有選擇性抗拮抗血小板活化因子的功能，作為血小板活化因子受體抗結劑，GBE可以直接對氣道炎癥細胞的聚集、活化進行抑制[13]，從而降低炎癥介質和細胞因子的釋放，降低氣道炎癥反應[14-15]。與此同時，炎性介質和細胞因子釋放的有效抑制也降低血小板活化因子的合成，進一步提高GBE的抗炎效果。

隨著國內外對GBE的化學成分及作用機制的研究不斷深入，對其藥用價值有了更深的了解和重視。GBE的成分決定具有多靶點綜合治療作用，副作用小，應用前景廣泛[16]。但是GBE主要成分的藥動力學特征受到物質本身理化性質及機體胃腸道環境的限制，口服GBE生理不用率不高[17]。在人體內GBE藥動力學研究，尤其是對吸收、分布、代謝等環節更加細致的研究尚顯薄弱。加上這方面的研究對GBE藥理作用的實質能夠有更加深入的了解，以便于指導臨床合理用藥、試劑改革、新藥研究。

綜上所述，GBE能夠抑制COPD大鼠氣道和全身炎癥反應，可能是通過降低血清及肺組織中CRP、IL-1、IL-8水平來實現。GBE具有抗變態反應、減輕氣道炎癥、提高機體免疫力等綜合治療作用，能夠廣泛應用于治療和預防呼吸系統疾病。