酶抑制法快速檢測有機磷農藥殘留的比較試驗

羅俊霞　趙建波　賈冬　尚航影　韓洛利　宋曉爽

摘要：采用6種商品化酶抑制法快速檢測試劑盒對敵敵畏、喹硫磷、敵百蟲、辛硫磷4種有機磷農藥進行了快速測定。結果表明，6種試劑盒對4種有機磷農藥的敏感性、檢出限各不一樣;6種試劑盒對4種有機磷農藥抑制率與農藥濃度的對數線性模擬回歸的線性范圍也不相同;取用3.0 mL的提取液和取用2.5 mL的提取液抑制率差別不大，僅有個別農藥在個別濃度水平下有差異。酶抑制法快速檢測試劑盒對各種有機磷農藥的檢測敏感性不同，在實際的檢測工作中，建議對抑制率≥10%的樣品進行復檢，同時采用色譜質譜進行了定性定量分析。

關鍵詞：酶抑制法;快速檢測;有機磷農藥;敏感性

中圖分類號：O656 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）18-0115-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.18.028 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Comparative test of enzyme reagent method for rapid detection of

organophosphorus pesticide residues

LUO Jun-xia1，ZHAO Jian-bo2，JIA Dong1，SHANG Hang-ying1，HAN Luo-li1，SONG Xiao-shuang1

（1.Zhengzhou Agricultural Product Quality Inspection and Circulation Center，Zhengzhou 450006，China;

2.Zhengzhou Agricultural Technology Promotion Center，Zhengzhou 450006，China）

Abstract： Four organophosphorus pesticides， including dichlorvos， quinthion， trichlorfon and octamphos-methyl， were rapidly determined by six reagent kits of commercial enzyme inhibition. The results showed that the reproducibility of pesticide residue in the rapid detection kit by enzyme inhibition decreased with the increase of inhibition rate. The sensitivity and detection limit of each reagent box to several pesticides were different. The inhibition rate of each reagent box for the four pesticides is not the same as the linear regression range of the logarithm of the pesticide concentration. There was little difference between 3.0 mL extraction and 2.5 mL extraction during the test， and individual pesticides differed at individual concentration levels. Since the reagent box for rapid detection of pesticide residues by enzyme inhibition method has different sensitivity for the detection of various pesticides， it is recommended that the sample with a suppression rate of ≥10% be reexamined in the actual test work， and that the chromatographic mass spectrometry be used for qualitative quantification.

Key words： enzyme inhibition method; rapid detection; organophosphorus pesticide; sensitivity

近年來，各種農藥在農業生產中使用越來越多，為應對市場發展的需求及加入WTO后國際市場的要求，國家加強了對農藥殘留的檢測，對農產品的監管提出了更高的要求。農藥殘留是農藥使用后殘存于農產品、生物體及環境中的農藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質的總稱[1]。而農藥殘留檢測方法主要有儀器分析法、生物檢測法和酶抑制法等。酶抑制法通過污染物對各種酶的抑制作用來表征污染物的綜合毒性，相比儀器分析法，該法具有操作簡單、快速等優點[2-6]，但酶的來源紛繁復雜，對各種有機磷和氨基甲酸酯類農藥的敏感程度也不同[7-13]，姜露等[12]、溫艷霞等[13]則更為深入地對植物酯酶中的麥麩酯酶和大豆酯酶進行了研究，劉永杰等[6]對羧酸酯酶進行了研究，黃志勇等[14]、汪葵等[15]將植物酯酶和膽堿酯酶進行了比較，鄭藝華等[16]對動物酯酶中的雞肝酯酶進行了研究，楊莉等[17]對豬肝酯酶與膽堿酯酶進行了比較，丁運華等[18]將3種不同來源的膽堿酯酶進行了比較試驗，張寧[19]則對動物膽堿酯酶和植物膽堿酯酶進行了比對試驗。基于這些研究，快速檢測產品應運而生，但據調查市售的商品快速檢測產品的酶源多數來源于動物酶源中的膽堿酯酶[20-27]，但商品化酶抑制法快速檢測農藥殘留的試劑盒對各種農藥的敏感程度需要使用單位進行甄別。

為了解基于酶抑制法的各種試劑盒對農藥的敏感性，篩選出更適應于快速檢測的酶抑制法檢測試劑盒，對6種商品化酶抑制法快速檢測有機磷農藥殘留的試劑盒進行試驗比較，以期對試劑盒的生產起到參考作用。

1 ?材料與方法

1.1 ?儀器與試劑

CL-BIII型16通道農殘速測儀（上海復博農業科技有限公司）;SHA-C型雙重恒溫水浴振蕩器（杰瑞爾電器有限公司）;HH.W21-Cr 420型電熱恒溫水浴鍋（北京三二八科學儀器有限公司）;WH-861型漩渦混合器;Rongtai 5 mL和Thermo 200 μL的移液槍;農藥殘留檢測試劑盒的品牌分別是深圳A試劑盒、廣州B試劑盒、東莞C試劑盒、廈門D試劑盒、湖北E試劑盒、深圳F試劑盒;由農業環境保護科研檢測所生產的濃度為1 000 mg/L的敵敵畏、喹硫磷、敵百蟲、辛硫磷等有機磷類農藥標準品，使用時稀釋成80 μg/mL的儲備液。

1.2 ?試劑配制

6種商品化檢測試劑盒里有緩沖試劑、酶試劑、顯色劑和底物，緩沖試劑用500 mL的去離子水溶解，酶試劑（乙酰膽堿酯酶）、顯色劑（二硫代硝基苯甲酸）和底物分別按照各試劑盒說明書的要求進行配制，具體方法見表1。

1.3 ?方法

1.3.1 ?試驗分組 ?試驗分別選用敵敵畏、喹硫磷、敵百蟲、辛硫磷4種農藥，每種農藥設置5個濃度，分別為0.05、0.50、1.00、2.00、3.00 mg/kg，每個濃度重復測定3次。同時，根據針對每種有機磷農藥每個濃度設置2個處理，為3.0 mL樣品溶液或2.5 mL樣品溶液。

1.3.2 ?樣品的檢測 ?分別取樣品溶液3.0 mL或2.5 mL于10 mL試管中，依次加入0.1 mL的酶液、0.1 mL的顯色劑，用旋渦混合振蕩器混勻，再用電熱恒溫水浴鍋在37 ℃水浴10 min，取出后加入0.1 mL的底物搖勻，立即放入儀器比色池中，用CL-BIII型16通道的農殘速測儀測定3 min內的吸光度變化值ΔA。同時，設置緩沖液溶液作為對照。

1.3.3 ?重現性試驗 ?通過試劑盒測定在不同濃度水平下對各種有機磷農藥的抑制率，計算抑制率的平均值和相對標準偏差，根據相對標準偏差比較各試劑盒測定4種農藥的重現性。

1.3.4 ?敏感性試驗 ?6種試劑盒對4種有機磷農藥抑制率與濃度的對數線性模擬回歸，獲得線性回歸方程，計算出IC50和IC10。將IC10確定為檢出限，將IC50確定為超標限，根據檢出限比較6種試劑盒對4種有機磷農藥的敏感性。

2 ?結果與分析

2.1 ?6種商品化試劑盒測定4種有機磷農藥的重現性分析

由表2可知，在6種商品化試劑盒中B試劑盒測定有機磷農藥的重現性最差，其次是D試劑盒;同時，對有機磷農藥敏感程度越高的酶試劑或農藥的濃度越高時測定有機磷農藥的重現性越好。重現性最差的B酶試劑測定濃度為0.05 mg/kg的辛硫磷時，當提取液體積為3.0、2.5 mL時變異系數分別為7.8、9.2，其抑制率分別為15.3%、12.6%;其次是B試劑盒測定濃度為0.50 mg/kg的敵敵畏時，當提取液體積為3.0、2.5 mL時變異系數分別為7.7、7.8，其抑制率分別為14.7%、13.0%;再次是B試劑盒測定濃度為0.05 mg/kg的喹硫磷時，當提取液體積為3.0、2.5 mL時變異系數分別為2.4、6.6，其抑制率分別為18.4%、5.8%;D試劑盒測定濃度為0.05 mg/kg的敵敵畏時，當提取液體積為3.0、2.5 mL時變異系數分別為1.9、5.6，其抑制率分別為48.1%、33.3%。其他變異系數基本在5.0以下，重現性相對較好。

2.2 ?6種商品化試劑盒對4種有機磷農藥的敏感性分析

2.2.1 ?6種商品化試劑盒對敵敵畏的敏感性比較 ?由圖1可知，6種商品化試劑盒測定敵敵畏，提取液體積為3.0和2.5 mL，其折線圖基本相同;B試劑盒測定時，敵敵畏濃度從0.05 mg/kg增加至3.00 mg/kg，其抑制率增幅最大，D試劑盒和F試劑盒增幅相差較小，C試劑盒和E試劑盒在最低濃度水平下，其抑制率就達100%或接近100%。從折線圖可以看出，綜合不同濃度測定結果，當提取液體積為3.0 mL 時，6種試劑盒對敵敵畏敏感性按照E試劑盒、C試劑盒、A試劑盒、D試劑盒、F試劑盒、B試劑盒的順序依次降低。

2.2.2 ?6種商品化試劑盒對喹硫磷的敏感性比較 ?由圖2可知，6種商品化試劑盒測定喹硫磷，提取液體積為3.0和2.5 mL時，其折線圖除了A試劑盒有差異外，其他圖形基本相似;C試劑盒和E試劑盒在測定濃度范圍內增幅相差較小，不同濃度水平下抑制率達100%或接近100%。從折線圖來看，綜合不同濃度測定結果，提取液為2.5 mL和3.0 mL時分別測定喹硫磷，其敏感性分別按照C試劑盒、E試劑盒、F試劑盒、B試劑盒、A試劑盒、D試劑盒的順序依次降低和E試劑盒、C試劑盒、D試劑盒、A試劑盒、F試劑盒、B試劑盒的順序依次降低。

2.2.3 ?6種商品化試劑盒對敵百蟲的敏感性比較 ?由圖3可知，6種商品化試劑盒測定敵百蟲，提取液體積為3.0和2.5 mL時，其折線圖除了A試劑盒差別較大外，其他基本相同。從折線圖來看，綜合不同濃度測定結果，提取液為3.0 mL時，6種商品化試劑盒對敵百蟲的敏感性按照D試劑盒、E試劑盒、C試劑盒、A試劑盒、F試劑盒（B試劑盒）的順序依次降低;提取液為3.0 mL時，對敵百蟲的感敏性按照D試劑盒、E試劑盒、C試劑盒、A試劑盒、B試劑盒（F試劑盒）的順序依次降低。

2.2.4 ?6種商品化試劑盒對辛硫磷的敏感性比較 ?由圖4可知，6種商品化試劑盒測定測定辛硫磷，提取液體積為3.0和2.5 mL時，其折線圖基本相同。從折線圖來看，綜合不同濃度測定結果，6種商品化試劑盒對敵敵畏的敏感性按照C試劑盒（E試劑盒）、D試劑盒、B試劑盒、F試劑盒、A試劑盒的順序依次降低。

2.3 ?6種商品化試劑盒測定4種有機磷農藥相關性及檢出限分析

2.3.1 ?6種試劑盒測定敵敵畏時相關性及檢出限分析 ?由表3可知，6種試劑盒測定敵敵畏時，C試劑盒和E試劑盒線性范圍比較窄，當濃度為0.5 mg/kg時，抑制率達到100%，在0.05～0.50 mg/kg的范圍內只包含2個點，相關系數為1.000 0。A試劑盒、B試劑盒、D試劑盒、F試劑盒4種試劑盒測定敵敵畏在0.05～3.00 mg/kg范圍內，提取液為3.0 mL和2.5 mL時，其抑制率和農藥濃度的常用對數呈現良好的線性關系，相關系數分別為0.947 9、0.846 2、0.889 6、0.895 8;0.896 9、0.877 0、0.889 4。從IC50和IC10結果來看，按照E試劑盒、C試劑盒、A試劑盒、D試劑盒、B試劑盒、F試劑盒順序對敵敵畏的敏感性逐漸降低。除了E試劑盒，F試劑盒、D試劑盒、C試劑盒、B試劑盒的檢出限均是3.0 mL低于2.5 mL，就測定敵敵畏而言，取用3.0 mL的提取液比取用2.5 mL的提取液靈敏度更高。

2.3.2 ?6種試劑盒測定喹硫磷時相關性及檢出限分析 ?由表3可知，6種試劑盒測定喹硫磷時，提取液為2.5 mL的C試劑盒和提取液為3.0 mL的E試劑盒均在濃度為0.05 mg/kg，其抑制率就達到100%;提取液為3.0 mL的C試劑盒和提取液為2.5 mL的E試劑盒均在濃度為0.5 mg/kg時抑制率就達到100%。B試劑盒、D試劑盒、F試劑盒3個品牌在0.05～3.00 mg/kg范圍內，提取液為3.0 mL和2.5 mL時，其抑制率和農藥濃度的常用對數呈現良好的線性關系，相關系數分別為0.981 8、0.994 3、0.950 6;0.985 8、0.988 7、0.960 7;就檢出限來看，按照A試劑盒、F試劑盒、B試劑盒、D試劑盒、C試劑盒、E試劑盒的順序依次降低，試劑盒靈敏度依次升高。

2.3.3 ?6種試劑盒測定敵百蟲時相關性及檢出限分析 ?由表3可知，6種試劑盒測定敵百蟲時，其酶抑制率方程的線性范圍不一致，在提取液體積為3.0 mL時，A試劑盒、D試劑盒兩個品牌線性范圍為0.05～3.00 mg/kg，B試劑盒、F試劑盒的線性范圍為1.0～3.0 mg/kg，C試劑盒、E試劑盒的線性范圍為0.05～2.00 mg/kg;在提取液體積為2.5 mL時，A試劑盒、D試劑盒、E試劑盒3個品牌線性范圍為0.05～3.00 mg/kg，B試劑盒的線性范圍為0.5～3.0 mg/kg，C試劑盒的線性范圍為0.05～1.00 mg/kg，F試劑盒的線性范圍為2.0～3.0 mg/kg。就檢出限來看，按照F試劑盒、B試劑盒、A試劑盒、C試劑盒、E試劑盒、D的順序依次降低，試劑盒的靈敏度依次升高。

2.3.4 ?6種試劑盒測定辛硫磷時相關性及檢出限分析 ?由表3可知，6種試劑盒測定辛硫磷，提取液體積為3.0和2.5 mL時，C試劑盒和E試劑盒均在濃度為0.05 mg/kg時，其抑制率就達到100%，無法擬合抑制率和濃度對數的曲線;其他試劑盒抑制率和濃度的常用對數均在0.05～3.00 mg/kg范圍內呈現較好的線性關系。就檢出限來看，按照A試劑盒、F試劑盒、B試劑盒、D試劑盒的順序依次降低，試劑盒的靈敏度依次升高。

3 ?結論

研究結果表明，6種商品化試劑盒對敵敵畏、喹硫磷、敵百蟲、辛硫磷的敏感性均不相同，可能因為試劑盒中酶的來源不同、提取的方法不同或酶的純度不同，說明試劑盒在酶的選擇和提取上應該嚴格控制。在日常的檢測工作中，使用A試劑盒，酶的重現性較高，不易受外界環境影響;而E試劑盒的重現性較差，受外界環境的影響較大。

按照蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測方法的國家標準和行業標準[28-32]，樣品的抑制率達到50%則判定為樣品超標，即是IC50所對應的濃度值，國家限量標準對每一種農藥的限量不同，試劑盒對農藥敏感性也不一，同時酶抑制法不能定性，因此在日常檢測中只要抑制率高于10%的樣品建議復檢。

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