血腦屏障體外模型的研究進展（綜述）

徐 麟 胡凱莉

該文綜述了國內外體外血腦屏障模型的發(fā)展現狀及其在應用方面的最新研究進展。

1 血腦屏障及其結構

血腦屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）是由腦毛細血管內皮細胞、周細胞以及星形膠質細胞足突形成的結構（見圖1）[1～3]。腦微血管內皮細胞（BMECs）是內皮細胞的一種，與其他器官中內皮細胞相比，腦中的內皮細胞質厚度均勻、沒有窗孔，低胞飲活性和連續(xù)的基底膜，并具有大量的線粒體數量，為酶分解化合物提供能量[4]。其能限制大部分外來物質進入腦部的同時，還通過各種選擇性運輸系統將營養(yǎng)素和其他化合物主動進出入大腦，維持正常的生理代謝功能[5]。

圖1 血腦屏障的結構

2 體外BBB模型

體外BBB模型作為現今研究神經系統疾病的主要體外模型，具有不同的結構及特征[6]。體外BBB模型能較為準確地預測出藥物在體內BBB的滲透率，其中常見的主要有單細胞模型、共培養(yǎng)模型（接觸模型、非接觸模型）以及3D模型三大類。因此，本文主要介紹常見的三大類型的體外BBB模型及應用，并對各個模型優(yōu)缺點進行分析。

2.1 單細胞模型 體外BBB單細胞模型（見圖2）指的是在Transwell膜上培養(yǎng)單一種類的內皮細胞，常用的細胞有犬腎細胞，小鼠腦血管內皮細胞（bEnd3）以及永生化人腦內皮細胞（hCMEC/D3）等。體外BBB單層細胞模型的優(yōu)點是模型簡單，允許以適中的成本進行相對較高的篩選。此模型還具有細胞存活時間長、細胞間連接緊密的一系列優(yōu)點。但是，由于細胞缺乏鄰近細胞信號傳導（星形膠質細胞和周細胞）和機械刺激（如剪應力）所提供的屏障性調節(jié)刺激，容易出現細胞加速去分化、細胞間形成的緊密連接不完整、細胞黏著不規(guī)則、細胞旁擴散等缺陷。通過大量研究證明[3,7]，BBB的性質主要是由大腦中的微環(huán)境決定的，而不是內皮細胞自身的性質決定，因此單層模型與體內實際情況并不一致。

圖2 體外血腦屏障單細胞模型

王利民等[8]通過采用大鼠腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞分別建立了兩種體外BBB單細胞模型，研究高溫下基質金屬蛋白酶9（MMP-9）對BBB微血管內皮細胞緊密連接蛋白（claudin-1）的影響。結果得知，高溫可導致體外BBB模型claudin-1 表達下降，BBB通透性增加。外源性添加MMP-9 能進一步加劇該損傷，提示高溫可通過MMP-9 加重BBB破壞。Ping Wang等[9]采用hCMEC/D3 細胞株建立體外BBB單細胞模型，研究白喉毒素的無毒突變體—交叉反應物質197（CRM197）潛在的作用和機制。結果表明，CRM197 表現出更傾向于頂端的細胞轉移，而不是基底的細胞轉移，這涉及到細胞穴樣內陷介導的內吞途徑。Caveolin-1 的上調和磷酸化-FOXO1A轉錄因子的下調可能是由CRM197 通過PI3K/Akt依賴通路介導導致的，以上研究結果表明，載體蛋白CRM197 介導的跨BBB傳遞參與了FoxO1a轉錄活性的誘導和Caveolin-1 表達的上調。

2.2 共培養(yǎng)模型 由于單獨培養(yǎng)的腦微血管內皮細胞會逐漸喪失血腦屏障特性，因此開發(fā)了共培養(yǎng)模型。共培養(yǎng)模型是指，采用兩種或兩種以上細胞共同培養(yǎng)來構建體外BBB模型，目前較多為二元共培養(yǎng)模型和三元共培養(yǎng)模型。共培養(yǎng)模型的優(yōu)點是適用范圍廣泛，是研究神經退行性疾病的損傷機制、滲透率、細胞間相互作用等的理想模型。但是它不提供對于內皮極化和緊密連接至關重要的剪切力，從而導致模型缺乏BBB的特征以及其內皮滲透性高于生理滲透率。

劉潛等[10]通過建立接觸型和非接觸型體外BBB共培養(yǎng)模型，研究了帕金森病（PD）細胞旁路開放對FLZ體外跨血腦屏障模型轉運特性的影響，其中FLZ是是全合成的新型番荔枝酰胺（squamosamide）衍生物。得出結論，生理和PD病理狀態(tài)下影響FLZ透過BBB的主要因素還是由BBB中P-gp介導的外排。為了模擬星形細胞對血腦屏障內皮細胞的影響，建立了不同的實驗系統，其中根據細胞在插板中的位置分為接觸型和非接觸型。

2.2.1 接觸型 接觸型共培養(yǎng)模型是將一種細胞（如內皮細胞）接種于插板內側，另一種細胞（如星形膠質細胞）接種于插板底部進行共培養(yǎng)的模型（見圖3）。雖然這種排列允許內皮細胞和星形膠質細胞直接接觸，然而與體內相比，人工膜相對較厚，因此限制了細胞與細胞的相互作用。

圖3 接觸型共培養(yǎng)模型

Guang-Yun Wang等[11]通過建立了星形膠質細胞（AC）與人臍靜脈內皮細胞（ECV304）共培養(yǎng)的接觸型體外BBB共培養(yǎng)模型，研究麝香酮是否能夠通過調節(jié)P-糖蛋白（P-gp）和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達來改變血腦屏障的通透性。結果表明，在BBB模型中加入麝香酮（8 IM）前后，TEER值無顯著性差異；用麝香酮（4 IM、8 IM、16 IM）處理24 h后，P-gp表達顯著下降；在糖氧剝奪狀態(tài)下，不同濃度的麝香酮組中P-gp和MMP-9 的表達均有不同程度的降低。結果表明，麝香酮可以滲透到BBB模型中，并與P-gp的抑制和MMP-9 的表達有關。該研究結果對了解麝香酮在BBB中的作用機制以及對治療腦血管疾病具有重要意義。

2.2.2 非接觸型 非接觸型體外BBB模型是將一種細胞（如內皮細胞）種在transwell上，另一種細胞（如星形膠質細胞）種在培養(yǎng)皿的底部（見圖4）。張樂裕等[12]通過建立Aβ1-42 誘導的小鼠腦微血管內皮細胞bEnd.3 和原代大鼠星形膠質細胞As非接觸式共培養(yǎng)BBB模型，探究黃芪甲苷對纖維狀Aβ1-42 誘導的體外BBB模型損傷的影響及其可能機制。MTT結果顯示，與模型組比較，黃芪甲苷低、高劑量組均能顯著提高bEnd.3 細胞活性（P＜0.001），且保護作用與黃芪甲苷對的濃度呈正相關；熒光素鈉通透性實驗結果顯示，與模型組相比較，黃芪甲苷預處理可顯著降低BBB的通透性（P＜0.001）。Western blotting 結果顯示，與模型組比較，黃芪甲苷預處理后，cleaved Caspase-3/Caspase-3 顯 著 降 低，ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表達水平顯著增加（P＜0.001）。由此得出結論，黃芪甲苷可能是通過抑制Aβ1-42 誘導的腦微血管內皮細胞 bEnd.3 的凋亡及增加其連接蛋白表達而發(fā)揮 BBB 保護作用。

圖4 非接觸型模型

2.3 新型體外血腦屏障模型—3D模型 3D NVU裝置主要采用玻璃和聚二甲基硅氧烷（PDMS）進行制備，該模型常見的細胞為bEnd.3、C8D1A，該裝置可進行3D細胞培養(yǎng)并提供5 dyn/cm2左右的剪切應力。該裝置的優(yōu)點是可以進行3D細胞培養(yǎng)、和細胞共培養(yǎng)，提供剪切應力，同時可以進行細胞的實時顯微觀察，但其依然存在無法實時監(jiān)測轉移上皮電阻值（TEER）值等問題[13]。

Alcendor DJ等[14]采用NVU芯片來制備體外3D BBB模型，NVU芯片由神經模塊（神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞）和血管模塊（BMECs）組成，兩個模塊分別細胞培養(yǎng)完成后再組裝在一起，通過該裝置研究神經血管間的相互作用。相關研究表明[15]，在裝置中加入腫瘤壞死因子α（TNF-α），可使葡萄聚糖的通透性增加2 倍，說明NVU芯片形成的體外3D BBB模型具備正常的功能。另外在血管模塊中添加TNF-α，也可促進神經模塊中小膠質細胞形態(tài)的變化并顯著增強膠質纖維酸性蛋白的表達，表明神經與血管間存在信息交換，表明該裝置在中樞神經系統相關藥物篩選應用中具有一定的優(yōu)勢。

3D BBB模型[16]主要采用PDMS進行制備，其常用的細胞類型是hCMEC/D3 和人星形膠質細胞，該模型可進行3D細胞培養(yǎng)并提供0.7 dyn/cm2左右的剪切力，該模型可用于藥物篩選，研究剪切應力、血管周期性收縮對BBB的物質運輸以及內皮細胞功能的影響等。該模型的優(yōu)點是能夠實現3D細胞的培養(yǎng)、細胞共培養(yǎng)，提供剪切應力和周期性收縮等力學變化。但是該模型在TEER的實時監(jiān)測和藥物高通量篩選方面還存在一定的缺陷[17]。

3 總結與展望

對體外血腦屏障模型的研究，以往文獻大多是使用細胞株來建立模型，且模型的功能性可靠性較差。近年來，體外血腦屏障模型包括不同的實驗細胞模型，達到了很好的效果。單細胞培養(yǎng)模型和多細胞模型相比，二元共培養(yǎng)模型優(yōu)于一元模型，星形膠質細胞對血腦屏障的誘導調節(jié)具有促進作用[18]。盡管各種體外血腦屏障模型的發(fā)展迅速，但是仍然具有很大的局限性，沒有已被確定的理想模型。模型的選擇是至關重要的，經常由具體研究目的決定。

總之，創(chuàng)新型納米制劑正變得越來越多，隨著體外血腦屏障模型的發(fā)展，能更準確地評價納米制劑在中樞神經系統疾病中的治療意義。體外血腦屏障模型的應用范圍廣泛，并不局限于在納米制劑中，僅僅用于評價納米制劑的模型文獻就有數百篇，體外血腦屏障模型能夠有效地對CNS疾病研究以及藥物的研發(fā)起到良好的推動作用。