SIRT1在肝癌中的表達及與耐藥相關蛋白P-gp、Top-Ⅱα的關系

周 書，許 勇，赫永金，許迪鋒，方 良，林祖慶

(杭州市大江東醫院 肝膽胃腸血管外科，浙江 杭州 311225)

肝細胞肝癌為世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，位居世界惡性腫瘤發病率的第5位[1]。多種癌癥基因或抑癌基因的異常表達，在肝癌的發生、發展及耐藥中起著關鍵作用[2-3]。沉默信號調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)為新近發現的一類依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸的第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶[4]。在多種成熟組織中表達，胚胎早期即生殖細胞中含量豐富[5-6]。近年來，SIRT1與腫瘤的關系成為腫瘤學研究的熱點問題之一，但在肝細胞肝癌中的作用的相關報道尚不多見。有報道顯示[7-8]，惡性腫瘤化療耐藥上SIRT1表現出促進、抑制兩種現象，我們推測SIRT1的過表達在肝細胞肝癌中的耐藥機制中發揮著重要的作用。基于此，本研究通過探討SIRT1在肝癌組織、細胞中的表達情況，SIRT1過表達與耐藥相關蛋白P-糖蛋白(P-gp)、拓撲異構酶Ⅱα(Top-Ⅱα)的相關性，為臨床合理用藥提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 組織標本 40例新鮮肝癌組織及匹配的癌旁組織取自剛切除的手術標本，手術后即刻投入液氮保存。分別取部分新鮮組織分離組織蛋白、制作免疫組化切片。

1.2 主要試劑與儀器 本研究中使用的主要試劑與儀器見表1。

表1 主要試劑與儀器

1.3 實驗方法

1.3.1 Western-blot 以研磨法勻漿肝癌組織，加400 μL單混有蛋白酶抑制劑的去污劑裂解液裂解組織，置于冰上操作。裂解30 min后，將裂解液轉移至1.5 mL EP管中，4℃ 12 000 rpm/min離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管，-20℃保存。以BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白樣品加10×上樣緩沖液，水浴煮沸5 min。以每孔30 μg蛋白的上樣量行聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓80 V，溴酚藍進入分離膠后調整電壓為120 V繼續電泳，至溴酚藍遷移至分離膠底部，終止電泳。以4℃，300 mA恒流，70 min，將蛋白轉移至PVDF轉膜上，麗春紅染色觀察轉膜效果。5%BSA封閉PVDF膜2 h，洗滌后，滴加兔抗SIRT1、P-gp、Top-Ⅱα溶液，4℃過夜孵育。第二天加入TBST洗滌去除多余一抗，與HRP標記的二抗室溫孵育2 h。TBST清洗后，加入ECL化學發光底物，在化學發光儀上顯影，拍照保存。

1.3.2 免疫組化 (1)固定、脫水、包埋。取組織放入4%多聚甲醛里面固定3～4 h，取適當大小組織放入包埋盒中，進行脫水。打開包埋機，將脫水后的組織連同包埋盒依次放入機器組織槽中，進行包埋。(2)切片、制片。打開切片機，固定蠟塊，用力均勻，右手搖動切片，左手用毛筆接片，制片。(3)組織化學染色。60℃干烤2 h脫蠟，二甲苯、梯度酒精、PBS沖洗凈殘余石蠟。以檸檬酸鈉，微波抗原修復，溫度控制在96 ℃～98 ℃。然后將切片放入熱鍋中15 min，最后自然冷卻室溫。以免疫組化筆圈圍住組織，并將切片放入濕盒中，盒中加入少量蒸餾水，滴加3%過氧化氫室溫孵育10 min。甩干水分，吸干水珠，加山羊血清封閉液，放入濕盒內，室溫10 min。滴加一抗蓋住組織，濃度為1∶200，然后放入濕盒內4 ℃過夜。第二天，4度冰箱取出濕盒，室溫復溫30 min，PBS沖洗，甩干水分，滴加二抗，室溫孵育10 min。每張片子滴加50 μL鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗凈后，100 μL DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10 min。染色合適即可終止染色，自來水沖洗。蘇木素復染，1～2 min，細胞核變藍色即可終止，0.5%氨水反藍，1%鹽酸酒精分化3 s，自來水沖洗3 min。梯度酒精脫水，涼干片子后滴加適量中性樹膠封片，蓋上蓋玻片，封片，顯微鏡下拍照保存。

免疫組化判斷標準：陽性顯色為不均質棕色顆粒，隨機選擇5個高倍鏡視野，腫瘤細胞染色陽性率≥25%為陽性，陽性染色率<25%為陰性。

1.3.3 細胞培養及蛋白提取 肝癌細胞系SMMC-7721、Bel-7402、MHCC97、HepG2、Huh7均購自中科院上海細胞庫。根據中科院上海細胞庫說明分別選擇DMEM培養基、RPMI 1640培養基，在37℃、含5% CO2的細胞培養箱中培養。細胞密度為整瓶80%～90%時傳代。以Western blot檢測各細胞株中SIRT1相對表達量，選擇相對表達量最高的肝癌細胞株加入使用濃度為98 nmol/L的SIRT1抑制劑，處理48 h后，以M-PER提取細胞總蛋白。

1.4 統計學分析 統計學軟件為SAS9.3。計量資料的比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數資料的比較采用卡方檢驗。連續變量的相關分析采用Pearson相關分析。均以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SIRT1、P-gp、Top-Ⅱα在肝癌中表達情況 免疫組織化學結果顯示，SIRT1在40例腫瘤組織中，35例呈陽性表達，陽性表達率87.50%。P-gp在40例腫瘤組織中，33例呈陽性表達，陽性表達率82.50%。Top-Ⅱα在40例腫瘤組織中，8例呈陽性表達，陽性表達率20.00%。腫瘤組織中SIRT1、P-gp陽性表達率顯著高于Top-Ⅱα，差異有統計學意義(P<0.05)。見封三圖1。

Western blot結果顯示，肝癌組織、癌旁組織中SIRT1灰度值分別為1.25±0.24、0.18±0.05； P-gp灰度值分別為1.16±0.23、0.17±0.06；Top-Ⅱα灰度值分別為0.19±0.08、1.12±0.20。肝癌組織中SIRT1、P-gp相對表達量顯著高于癌旁組織，肝癌組織中Top-Ⅱα相對表達量顯著低于癌旁組織；差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 肝癌與癌旁組織中SIRT1、P-gp、Top-Ⅱα相對表達量

2.2 SIRT1與P-gp、Top-Ⅱα表達的相關性分析 以Western blot檢測的相對表達量數據做相關性分析，SIRT1與P-gp表達量呈正相關(r=0.915，P<0.05)，SIRT1與Top-Ⅱα呈負相關(r=-0.906，P<0.05)。見圖2。

2.3 SIRT1在肝癌細胞系中表達情況 在肝癌細胞系中，SMMC-7721中SIRT1相對表達量顯著高于其他肝癌細胞系，其次為Bel7402，再次為MHCC97，再次為HepG2，最后為Huh7；差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 SIRT1抑制后P-gp、Top-Ⅱα表達情況 在SMMC-7721細胞中， 加入使用濃度為98 nmol/L的SIRT1抑制劑Selisistat后，SIRT1、P-gp表達量顯著下降，Top-Ⅱα表達量顯著提高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖2 SIRT1與P-gp、Top-Ⅱα表達量的相關性

圖3 肝癌細胞系中SIRT1相對表達量

圖4 SMMC-7721細胞中給予Selisistat處理對P-gp、Top-Ⅱα表達的影響

3 討論

SIRT1在多種腫瘤的發生、發展過程中有著重要的作用[10-11]。有報道顯示[12-14]，SIRT1基因在胃癌、前列腺癌、原發性結腸癌、急性髓細胞性白血病中均呈高表達，對多種正常生理性過程有著調節作用，如細胞增殖、炎癥反應、ATP生成、胰島素分泌、尿素循環等[15-16]。研究表明[17]，SIRT1可通過去乙酰化修飾組蛋白，去乙酰化P53、FOXO等非組蛋白及DNA損傷修復蛋白等，參與細胞衰老、腫瘤發生。也有報道顯示[18]，SIRT1在多重耐藥(multi-drug resistance, MDR)中具有重要的作用，在化療耐藥的腫瘤細胞中SIRT1表達顯著升高。多重耐藥為惡性腫瘤化療中的難點之一，發生機制復雜，臨床上逆轉途徑小，效果不甚理想。目前的研究發現[19]，多重耐藥主要通過P-gp蛋白/多重耐藥-1基因介導的改變藥物在細胞內聚集，引起細胞內藥物濃度降低、特殊藥物靶點缺失，如Top-Ⅱα表達缺失等。基于此，我們推測SIRT1在肝癌中的異常表達可能與多重耐藥密切相關。

在肝癌組織中，我們以Western blot及免疫組織化學的方法觀察SIRT1的表達量，結果顯示，SIRT1在40例腫瘤組織中的陽性表達率顯著高于Top-Ⅱα，為Top-Ⅱα陽性表達率的3.38倍。在肝細胞肝癌細胞系中，5株細胞均有不同程度陽性表達。故我們認為，在人肝癌組織中SIRT1總體表達量較正常組織升高，提示SIRT1可能為一種促癌因子。進一步觀察肝癌組織中耐藥相關蛋白P-gp、Top-Ⅱα的表達情況，結果顯示，P-gp陽性表達率顯著高于Top-Ⅱα，為Top-Ⅱα陽性表達率的3.13倍。Western blot結果也證實，P-gp相對表達量高于Top-Ⅱα。P-gp為ATP依賴的細胞膜轉運體，有MDR1基因編碼，可將細胞毒性物質、各種抗腫瘤藥物排出細胞[19]。Top-Ⅱα為ATP依賴性酶，存在于各種正常分裂的細胞、腫瘤細胞中，在染色體形成、分離、DNA復制等過程中有著重要的作用[20]。既往的研究表明[21]，腫瘤細胞內P-gp含量越高，腫瘤對化療的敏感性越低，Top-Ⅱα含量越高對Top-Ⅱα抑制劑敏感性越高，Top-Ⅱα表達下降可導致腫瘤對化療藥物的耐受。這與我們檢測腫瘤組織中P-gp、Top-Ⅱα的表達結論一致，說明肝癌的耐藥機制可能與P-gp、Top-Ⅱα異常表達有關。SIRT1與P-gp、Top-Ⅱα表達量的相關性分析結果表明，SIRT1與P-gp表達量呈正相關，SIRT1與Top-Ⅱα呈負相關。提示SIRT1可能參與了P-gp、Top-Ⅱα的異常表達，影響多重耐藥的發生。為驗證相關性分析的結果，我們選擇在SIRT1表達量最高的SMMC-7721細胞中，給予98 nmol/L的SIRT1特異性抑制劑Selisistat處理，結果顯示，處理后SIRT1、P-gp表達量顯著下降，Top-Ⅱα表達量顯著升高，說明SIRT1可能通過促進P-gp蛋白，降低Top-Ⅱα蛋白表達來促進肝細胞肝癌的多重耐藥[22]。

綜上所述，SIRT1在肝癌組織中表達量高于癌旁組織，SIRT1高表達與耐藥相關蛋白P-gp呈正相關，與Top-Ⅱα呈負相關。SIRT1可能參與肝癌多藥耐藥發生，可能與調控P-gp、Top-Ⅱα蛋白有關。