良惡性肺結節影像組學特征與分子標記物相關性研究

康書朝，丁忠祥，崔 鳳，馮 琪，王 玫，牛家玲，王羅羽

(1.杭州市中醫院 放射科，浙江 杭州 310007； 2.浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院 放射科， 浙江 杭州 310006)

腫瘤的分子生物學行為決定了病灶的病理形態學特征，同時也是不同影像學特征的基礎?；蛲蛔兗跋嚓P蛋白表達與影像學特征關聯性的研究將影像學研究范圍拓展到微觀的分子領域[1-2]。隨著分子靶向治療的深入研究，尤其是針對表皮生長因子(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變的酪氨酸激酶抑制劑的出現，肺癌中EGFR突變陽性患者的總生存期超過2年[3]。EGFR是酪氨酸激酶活性的細胞膜受體，主要與腫瘤細胞的增殖、遷移、血管生成、抑制凋亡及藥物抵抗有關[4]。EGFR敏感突變被確定為預測EGFR療效最可靠的生物標志[5]。Ki-67抗原與腫瘤關系的研究表明[6]，Ki-67在腫瘤組織中含量越多，腫瘤細胞增殖越活躍，Ki-67與腫瘤的發生發展、分期、分級、復發及預后顯著相關。Ki-67在多種實體惡性腫瘤中的表達遠高于正常組織，能反映惡性腫瘤的增殖活性[7]。本研究旨在探索EGFR突變和Ki-67蛋白在肺腺癌中的表達情況及其與影像組學定量特征之間的相關性。

1 資料和方法

1.1 一般資料 采用回顧性方法收集杭州市中醫院2013年6月—2018年6月經病理證實的肺結節患者120例。所有患者均經病理證實分別為肉芽腫性病變、肺原位癌、微浸潤性肺腺癌和浸潤性肺腺癌，每組各30例。肉芽腫性病變組為良性肺結節，男12例，女18例；年齡42～85歲，平均68.0±13.5歲。肺原位癌組、微浸潤性肺腺癌組和浸潤性肺腺癌組為惡性肺結節，肺原位癌男17例，女13例；年齡45～81歲，平均70.0±15.1歲。微浸潤性肺腺癌男18例，女12例；年齡45～81歲，平均74.3±11.0歲。浸潤性肺腺癌男16例，女14例；年齡45～88歲，平均72.3 ± 15.3歲。所選患者均有完整的EGFR基因、Ki-67蛋白統計資料。本研究經醫院倫理委員會批準，所選患者均簽署知情同意書。

1.2 肺CT檢查方法 均采用Philips 256i CT(飛利浦公司)進行肺部CT掃描，采用肺部掃描模式，范圍從肺尖到肺底，層厚5 mm，層間距5 mm，重建層厚1.5 mm，螺距1.0，矩陣512×512，管電壓120 kV，自動毫安秒技術，迭代算法圖像重建，視野(FOV)330 mm，肺窗窗寬1500，窗位-400。

1.3 肺CT影像組學定量特征 采用ITK-SNAP軟件進行圖像分割。選取層厚為1.5 mm的肺部CT圖像，在包含選定肺結節的所有層面沿病灶輪廓逐層放置感興趣區(region of interest, ROI)，去除鈣化區域進一步調整ROI。將肺結節原始圖像和分割好的肺結節立體ROI圖像導入Artificial Intelligent Kit(AK)軟件。通過AK軟件對數據進行異常值處理、數據劃分、數據預處理，然后進行單因素方差分析+秩和檢驗，Spearman相關性分析，Lasso回歸及十折交叉驗證，提取影像直方圖、形態學、灰度共生矩陣(GLCM)、灰度游程長矩陣(RLM)4個方面的影像組學特征。

1.4 EGFR基因位點突變檢測 采用人EGFR基因突變檢測試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司)，進行熒光定量PCR檢測。存在EGFR基因19、21位點突變的病例為EGFR突變組(陽性組)，不存在EGFR基因19、21位點突變的病例為EGFR野生型組(陰性組)。

1.5 Ki-67蛋白表達檢測 采用即用型快捷免疫組化MaxVisionTM 2/HRP試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)進行檢測。細胞核呈黃色或者棕色者為Ki-67蛋白表達陽性，由兩位高年資病理醫師根據切片中細胞核染色程度分為Ki-67陽性組和Ki-67陰性組。

1.6 統計學方法 影像組學特征數據統計采用AK軟件自帶的統計軟件，其余數據采用統計學軟件SPSS 19.0。計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，等級資料指標相關性分析采用Spearman相關性分析(r≥0.8，兩變量間高度相關；0.5 ≤r<0.8，兩變量中度相關；0.3 ≤r<0.5，兩變量低度相關；r<0.3，兩變量低度相關程度弱，基本不相關)，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺影像組學特征 120例肺結節的原始圖像與分割后的圖像一起導入AK軟件，共獲取396個影像組學特征，采用單因素方差分析+秩和檢驗方法降維后篩查出221個特征。進一步對221個特征使用Spearman相關性檢驗方法去冗余后剩余75個特征，最后選用Lasso降維方式及十折交叉驗證，特征數降至5個，見表1。

表1 通過降維篩選的5個肺影像組學特征

注：RLM：灰度游程長矩陣；GLCM：灰度共生矩陣。

2.2 肺結節患者EGFR基因突變和Ki-67表達情況 不同性別，年齡段肺結節患者的EGFR基因突變和Ki-67表達陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與肉芽腫性病變比較，微浸潤性腺癌和浸潤性腺癌的EGFR基因突變陽性率均增高，原位癌、微浸潤性腺癌和浸潤性腺癌的Ki-67表達陽性率均增高，差異均有統計學意義(P<0.05)；見表2。

表2 肺結節患者EGFR基因突變和Ki-67表達情況

注：*與肉芽腫性病變比較，P<0.05。

2.3 影像組學特征與EGFR基因突變和Ki-67表達情況相關性分析 EGFR基因突變與Inertia_AllDirection_offset4參數正相關(r=0.564,P=0.040)，Ki-67蛋白表達分別與ShortRunlEmphasis_AllDirection_offset1(r=0.359,P=0.042), InverseDifferenceMoment_AllDirection_offset4(r=0.549,P=0.038), Inertia_AllDirection_offset4(r=0.423,P=0.047)正相關，見表3。

表3 肺結節患者影像組學特征與EGFR基因突變和Ki-67表達情況相關性分析

3 討論

傳統的影像測量方法不能準確反映腫瘤的微觀變化，醫學影像分析模式需從傳統的醫師主觀判斷向精準定量分析模式轉化。目前影像組學已經發展成為融合影像、基因、臨床等信息的輔助診斷、分析和預測的工具[8-9]。CT影像組學在預測非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)分子特征方面具有較大的優勢，有望在肺癌的個體化治療方面發揮重要作用。本研究共觀察120例肺結節的CT影像，使用AK軟件對良惡性肺結節定量特征降維，篩選得到5組有統計學差異的影像組學特征。

張連美等[10]研究顯示，肺癌EGFR基因突變陽性率為62.9%。本研究90例肺腺癌中，EGFR基因突變陽性率為25.56%(23/90)，陽性率低于文獻報道，可能與張連美等的研究沒有限制肺腫瘤的類型及大小有關。有研究表明[11]，腫瘤的類型及大小與EGFR基因突變率有一定的相關性，肺鱗癌組織中EGFR基因突變陽性率高于肺腺癌組織中EGFR基因突變陽性率，肺腫瘤直徑越大，EGFR基因突變陽性率越高。本研究納入的惡性肺結節均為肺腺癌且直徑均小于3 cm，可能是導致EGFR基因突變陽性率相對較低的原因。本研究結果顯示，與肉芽腫性病變比較，微浸潤性腺癌和浸潤性腺癌的EGFR表達陽性率均明顯增高，提示肺腺癌與EGFR基因突變有一定的關聯[4,11-12]。本研究的EGFR基因突變與影像組學特征的相關性分析結果顯示，EGFR基因突變與肺紋理特征Inertia_AllDirection_offset4參數呈中度相關性。Inertia反映圖像的清晰度和紋理溝紋深淺的程度，本研究結果提示EGFR基因突變在微觀形態上可改變肺CT圖像紋理溝的深度。有研究采用CT影像組學特征預測NSCLC的EGFR突變狀態[13]，結果顯示影像組學預測EGFR突變狀態的ROC曲線下面積達到0.89。

Ki-67蛋白存在于細胞核內，Ki-67能客觀地反映機體細胞的增殖活性[14]。Ki-67的表達強度與肺癌淋巴結轉移、臨床分期密切相關，高表達可作為腫瘤轉移的標志；Ki-67陽性表達率與肺腺癌的分化程度呈負相關，Ki-67標記指數已成為鑒別腫瘤良惡程度及侵襲力的重要標志之一[15-17]。本研究結果顯示，90例肺腺癌中，Ki-67表達陽性率為67.78%(61/90)；與肉芽腫性病變比較，原位癌、微浸潤性腺癌和浸潤性腺癌的Ki-67表達陽性率均明顯增高。同時本研究結果顯示，Ki-67蛋白表達分別與ShortRunlEmphasis_AllDirection_offset1, InverseDifferenceMoment_AllDirection_offset4, Inertia_AllDirection_offset4呈正相關，提示Ki-67蛋白的表達可改變肺CT圖像的光滑程度和紋理溝的深淺，改變圖像局部紋理的同質性；通過肺紋理特征，可以較低的成本、客觀地判斷腫瘤的增殖活性，可更早更快速地對肺腺癌進行診治和預后。

綜上，肺結節組織中EGFR基因位點突變和Ki-67蛋白表達與肺腺癌影像組學特征有一定的相關性，結果還需從擴大肺結節病理類型、擴大樣本量、增加機器型號、優化掃描參數等方面進一步驗證。