一株溶磷菌的抗逆促生特性及對種子萌發的研究

(貴州大學生命科學學院， 貴陽 550025)

紅壤廣泛分布于我國南部和中部的熱帶和亞熱帶地區，面積113萬km2，占全國面積的11.8%，是我國南方典型土壤類型，由于其特殊的成土過程，土壤中粘粒和氧化鐵、鋁含量均較高，土壤“酸”、“瘦”、“板”、“結”的自然特點使得土壤磷素水平較低[1]。微生物具有極強的適應能力，因而從紅壤中分離獲得具有溶磷特性的微生物成為可能。溶磷菌能使土壤中難溶性或不溶性的磷轉化為可溶性磷形式，加速土壤中無效磷的有效化，以利于植物對磷的吸收和利用[2]。高效溶磷菌的篩選不但可以解決土壤磷素缺乏，又能預防紅壤退化和水源污染[3]。戴沈艷等[4]從江西鷹潭紅壤中分離獲得一株高效解磷菌T 4，其溶解磷酸鋁、磷礦粉的能力較高，經鑒定為伯克霍爾德氏菌屬，田間施用該菌株可以提高水稻產量。鄭文波等[5]從江西紅壤花生地中篩選出3株產吲哚乙酸(indoleacetic acid,IAA)的菌株，其中巨大芽孢桿菌菌株ZH 5具有較強的解磷能力，對于磷酸三鈣的溶磷量達164.73 mg·L-1。而從鹽堿地和貧瘠的巖石中生長的嗜鹽野草根部篩選到具溶磷能力的PGPR菌株，作為拌種劑能促進鷹嘴豆的生長[6]。本研究采集紅壤進行溶磷菌的分離，研究其抗逆促生特性，并對花生和辣椒種子進行浸種處理，探討該菌株的促生效應，為進一步研制微生物菌肥奠定基礎。

1 材 料

1.1 供試土樣及種子

分離菌株土樣來自于貴州省遵義市寬闊水自然保護區土壤(107°9′E，28°13′N)，取10～20 cm土層樣品，保存于無菌采樣袋中。該區域為紅壤，間有巖石，上有雜草及灌木叢生，土壤pH值5.5。供試花生及辣椒種子均為當地市售種子。

1.2 培養基

NBRIP培養基[7]：采用國際植物研究所磷酸鹽生長培養基，成分為葡萄糖10 g，MgCl2·6 H2O 5 g，Ca3(PO4)5 g，MgSO4·7 H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0，115 ℃滅菌30 min。固體培養基則加入2%瓊脂。

LB培養基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0，121 ℃滅菌20 min。

TSB培養基[8]：葡萄糖2.5 g，大豆胨3 g，胰蛋白胨17 g，NaCl 5 g，K2HPO42.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.1～7.5，115 ℃滅菌30 min。

DF培養基[9]：KH2PO44 g，MgSO4·7 H2O 0.2 g，Na2HPO46 g，葡萄糖2 g，葡萄糖酸鈉2 g，檸檬酸2 g，(NH4)2SO42 g，組分一、組分二溶液各0.1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.2，115 ℃滅菌30 min。其中組分一為H3BO310 mg，MnSO4·H2O 11.19 mg，ZnSO4·7 H2O 124.6 mg，CuSO4·5 H2O 78.22 mg，MoO310 mg，溶于100 mL滅菌蒸餾水中；組分二為FeSO4·7 H2O 100 mg溶于10 mL滅菌蒸餾水中。

ADF培養基：將ACC(1-氨基環丙烷-1-羧酸)溶于超純水，過濾滅菌，加到不含(NH4)2SO4的滅菌DF培養基中，終濃度為3.0 mmol·L-1。

1.3 主要試劑及儀器

細菌DNA提取試劑盒，Omega公司；16 SrRNA基因擴增引物27 f/1492 r合成及Taq聚合酶，大連TaKaRa公司；其余試劑均為國產分析純。S 1000快速梯度PCR儀及Gel-DocXRS+凝膠成像系統，Bio-Rad公司；UV 8000紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；ZWYR-D 2403三層恒溫振蕩搖床，上海智城儀器有限公司。

2 方 法

2.1 溶磷菌菌株的分離

稱取土壤10.0 g于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩制備土壤懸液，經10倍倍比稀釋，選擇適當的稀釋度涂布于NBRIP固體培養基平板上，30 ℃恒溫培養箱中培養3 d，挑取水解圈大的菌落進行純化并保種，點種法測定所分離菌株的水解圈直徑及菌落直徑。

2.2 溶磷菌菌株溶磷能力的動態測定

將菌株于LB培養基中過夜活化后，轉接入NBRIP液體培養基中，置于30 ℃條件下、150 r·min-1搖床振蕩連續培養9 d，以不接菌的相同培養基為空白對照，每個處理重復3次。培養過程中，每隔24 h取樣，培養液經4 000 r·min-1離心25 min，取上清液測定pH值及可溶性磷含量，可溶性磷含量采用鉬藍比色法進行測定[10]。

2.3 溶磷菌菌株的分子鑒定

將保存菌株于LB液體培養基中過夜活化后，利用細菌DNA提取試劑盒提取菌株總DNA。以細菌總DNA為模板，細菌16 SrRNA基因擴增通用引物27 f/1492 r進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，包括2×PremixTaq12.5 μL，10 μmol·L-1引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，雙蒸水補足；PCR條件為：95 ℃10 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃ 7 min[11]。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，有目的大小條帶者(1 500 bp左右)送至上海英駿生物工程有限公司測序。測序獲得的菌株16 SrRNA基因序列使用BLAST進行同源性比較，聯合EzTaxon-e數據庫進行分子鑒定。

16 SrRNA基因通用引物序列為：27 f:5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’,1492 r:5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’[12]。

2.4 溶磷菌菌株的抗逆能力研究

選擇溫度、酸堿性及鹽濃度進行菌株的抗逆能力研究。溫度設置了20 ℃、30 ℃、37 ℃、45 ℃及50 ℃共5個梯度，將菌株活化后轉接于LB培養基中，經不同溫度下搖床150 r·min-1振蕩培養24 h后測定菌體生長量(OD600值)；酸堿性設置了pH值為4.0、5.0、7.0、9.0、10.0和11.0等6個梯度，活化菌液分別轉接于不同pH值的LB培養基中，30 ℃條件下搖床振蕩培養24 h后測定OD600值；設置培養基中NaCl濃度分別為1%、2%、5%、7%和10%共5個鹽濃度梯度，接種菌株后定時測定OD600值；每個處理均設3次重復。

2.5 不同鹽濃度脅迫下對菌株溶磷能力的影響

以NBRIP為基礎培養基，分別添加NaCl至終濃度為0%、2%、5%、7%和10%，以不接菌的相同培養基為空白對照，每個處理均設3個重復。活化菌株轉接于含不同NaCl濃度的NBRIP培養基中，于30 ℃、150 r·min-1振蕩培養8 d后測定培養液pH值及上清液可溶性磷含量。

2.6 溶磷菌菌株分泌ACC脫氨酶活性的測定

菌株經60 mL TSB培養基中30 ℃搖床振蕩培養24 h后、8 000 r·min-1離心10 min，菌體沉淀用DF培養基洗滌2次、重懸于24 mL ADF培養基中培養24 h；菌體經離心收集后用0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH值為7.6)洗滌2次，并重懸于600 μL 0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH值為8.5)中，加入30 μL甲苯混合振蕩30 s以破碎細胞，測定所獲粗酶液的蛋白濃度及ACC脫氨酶活性。利用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，ACC脫氨酶的測定是將20 μL 0.5 mol·L-1ACC加入200 μL粗酶液中，30 ℃水浴15 min后，以0.56 mol·L-1HCl(1 mL)終止反應；離心取上清加入800 μL相同濃度HCl及300 μL 2,4-二硝基苯肼(0.2%，以2 mol·L-1HCl溶解)，繼續水浴30 min后，加入2 mol·L-1NaOH混勻后測定OD540值。ACC脫氨酶活的表示方法為反應條件下，每毫克菌體蛋白每小時催化ACC脫氨形成ɑ-丁酮酸的微摩爾數，單位μmol·(mg·h)-1[11,13]。

2.7 溶磷菌菌株對花生種子萌發及幼苗生長的影響

用20%過氧化氫溶液對花生種子消毒20 min，無菌蒸餾水清洗3～4次后浸泡6～12 h，置于經LB培養基過夜活化的溶磷菌菌液中(OD600=1.0)浸種2 h，待風干后再放置于鋪有無菌濾紙的培養皿中，30 ℃條件下3 d，期間保持濾紙濕潤，統計花生發芽率；隨后移栽于裝有300 g土壤的育苗盆中，常規培育30 d后測定幼苗株高、鮮重及根長。以經未接菌的空白LB培養基浸種2 h的花生為對照組，設3組重復，每組25粒；盆栽實驗設3組重復，每組6株幼苗。

2.8 溶磷菌菌株對辣椒種子萌發及幼苗生長的影響

用3%NaClO溶液對辣椒種子消毒10 min，蒸餾水清洗多次，于溶磷菌菌液中(OD600=1.0)浸種2 h，對照經未接菌的空白LB培養基相同條件處理；再置于鋪有濾紙的培養皿中，30 ℃黑暗條件下放置15 d，統計辣椒發芽率；之后移栽于育苗盆中常規培育，30 d后測定幼苗生長指標，以經未接菌的空白LB培養基浸種2 h的辣椒種子為對照組，種子及幼苗重復設置同上。

2.9 數據分析與處理

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。

3 結果與分析

3.1 溶磷菌菌株的分離及溶磷能力

經過對采集土樣進行溶磷菌的分離及純化，獲得具有溶磷水解圈的菌株24株，點種法測定在NBRIP固體培養基上的水解圈及菌落大小，獲得一株溶磷能力最強的細菌菌株HGD 12，溶磷水解圈/菌落直徑之比為3.81(圖1)。

圖1 HGD 12菌株在NBRIP培養基上的溶磷水解圈

追蹤HGD 12菌株在NBRIP培養基中的溶磷動態(圖2)，結果發現，隨著培養時間的延長，上清液中的可溶性磷含量逐漸上升，而培養基pH值呈逐漸下降趨勢，至培養8 d達到最高值；此時，該菌株培養液的可溶磷含量達248.04 μg·mL-1，pH值為4.28，下降了2.26個單位，表現出較強的溶磷能力。

3.2 溶磷菌菌株的分子鑒定

提取HGD 12菌株的總DNA，以通用引物27 f/1492 r擴增該菌株的16 SrRNA基因序列，測序結果顯示與BacillusflexusGD 12(NCBI登錄號：MH 393213)以及B.flexusXh 8(NCBI登錄號：MK 012676)菌株的16 SrRNA基因同源性分別為99.64%和99.50%，初步鑒定HGD 12菌株為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

圖2 HGD 12菌株在NBRIP培養基中的溶磷動態

3.3 溶磷菌菌株生長的抗逆性

將HGD 12菌株置于不同的環境條件下測定菌體的生長量，結果(圖3，圖4)表明，該菌株的最適生長條件為30 ℃、pH值為5.0～9.0；在20～37 ℃、pH值為10.0～11.0、低于7% NaCl范圍內生長良好，溫度高達45 ℃時仍有一定的生長；而當培養基中的NaCl濃度為10%時，菌株經24 h適應期后仍可緩慢生長，體現出HGD 12菌株具有較強的耐熱、抗酸堿和抗鹽的特性。

注：小寫字母代表不同處理之間差異顯著(p<0.05)。圖3 HGD 12菌株在不同溫度及pH條件下的生長量

圖4 HGD 12菌株在不同鹽濃度下的生長曲線

3.4 不同鹽濃度脅迫下菌株的溶磷能力

以8 d培養上清液中的可溶磷含量為指標，分析了HGD 12菌株在不同NaCl濃度中的溶磷性。結果(圖5)發現，當培養基中添加NaCl時，溶磷能力顯著降低，10%鹽濃度下不具溶磷性；培養基中的鹽濃度為1%時，可溶磷含量為113.94 μg·mL-1，是無鹽脅迫時的46.26%；但在2%～7%鹽濃度范圍內，溶磷能力變化不大，可溶磷含量維持在60.65～81.03 μg·mL-1之間，表明HGD 12菌株在高鹽脅迫下仍具有一定的溶磷能力。

圖5 HGD 12菌株在不同NaCl濃度下的溶磷能力

3.5 菌株分泌ACC脫氨酶活性的能力

1-氨基環丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate,ACC)是乙烯合成的前體物質，ACC脫氨酶可以把ACC分解為氨和α-丁酮酸以減少乙烯合成，提高植物對逆境的抵抗能力[14]。經過測定，HGD 12菌株分泌的ACC脫氨酶活性為0.27μmol·(mg·h)-1，由于ACC脫氨酶通常與抗逆能力直接相關，這也與該菌株的耐酸堿、耐鹽及高鹽濃度下仍具溶磷特性相一致。

3.6 溶磷菌菌株對花生及辣椒種子萌發及幼苗生長的影響

利用HGD 12菌株的培養液對花生種子進行浸種處理后，種子發芽率較對照提高了21.34%，呈顯著差異。移栽至育苗盆中繼續培育30 d后測定花生幼苗的生長性狀，發現HGD 12菌株的浸種處理可以顯著提高花生植株的鮮重、株高及根長(p<0.05)；其中，處理組花生較對照的鮮重、株高及根長分別增加了25.47%、12.62%和56.73%，對根長的影響效果尤為突出(表1)。

表1 HGD 12菌株浸種處理對花生種子萌發及幼苗生長性狀的影響

處理發芽率/%鮮重/g株高/cm根長/cmHGD12浸種90.67±5.00b5.32±0.70b32.94±1.94b8.04±1.87bck69.33±1.89a4.24±0.15a29.25±2.94a5.13±0.53a

注：小寫字母代表接種組和對照組差異顯著(p<0.05)。下同。

表2 HGD 12菌株浸種處理對辣椒種子萌發及幼苗生長性狀的影響

處理發芽率/%鮮重/g株高/cm根長/cmHGD12浸種94.67±1.89b0.14±0.01b3.09±0.21b8.96±0.38bck70.67±5.00a0.11±0.01a2.22±0.19a4.10±0.40a

對辣椒種子進行浸種處理后，與對照相比，不僅種子的萌發明顯加快和提前，且發芽率較對照提高了24.00%(p<0.05)。后續培育30 d后對辣椒幼苗的生長指標進行測定，結果發現，與對照相比呈顯著差異，浸種處理辣椒的鮮重、株高及根長分別增加了31.5%、39.20%和118.40%，根長增加極為顯著(表2)；而且，圖上可以明顯看出HGD 12處理組的辣椒幼苗根長明顯，根系更為發達(圖6)。顯然，HGD 12菌株的浸種處理對于花生、辣椒種子的萌發及幼苗的生長均有顯著的促生作用，尤以對根長的影響更為明顯。

圖6 HGD 12菌株浸種處理對辣椒幼苗的促生效應

4 結論與討論

溶磷菌是一類能將土壤中難溶態的磷轉化為可供植物直接吸收利用的可溶性磷的一類特殊的微生物功能類群。不同的溶磷菌能降解的難溶性磷化合物存在很大差異，而降解磷的過程極其復雜。有研究表明，呼吸作用放出CO2、質子、蛋白質和胞外多糖等代謝產物都能起到增強菌株溶磷的作用[15]。在自身代謝的過程中，大多數的溶磷菌可以釋放出有機酸類物質而使環境pH值降低，或者溶磷菌也可通過NH4+的同化作用釋放質子而降低pH值，都可導致難溶性磷的可溶化[16-17]。HGD 12菌株在溶磷定性檢測和定量測定中，均表現出較強的溶磷特性，且動態測定結果也顯示隨著溶磷量的增加，培養液中的pH值呈逐漸下降趨勢，在培養8 d后較對照下降了2.26個單位，這個結果也預示著該菌株的溶磷機制與有機酸的產生或質子的釋放有關。

近年來，利用具有促生作用的微生物作為添加基質或拌種處理的報道逐漸增多。Arvind等研究表明，不動桿菌菌株BIHB 723具有溶解無機磷和有機磷的特性，拌種能促進豌豆、鷹嘴豆、玉米、大麥的生長[18]。而采用拌土和噴霧方式配套使用根際促生菌制劑YHN，可以顯著增加番茄和茄子的株高、葉面積、根部鮮重和地上部鮮重[19]。譚石勇等[20]從苧麻根和根圍土壤中分離獲得2株伯克霍爾德氏菌菌株，具有溶磷解鉀、產鐵載體、IAA和產氨能力等多種促生特性，種子萌發和盆栽實驗表明均能顯著促進苧麻種子的萌發和植株的生長。趙偉進等[21]從西藏黑青稞根際篩選到的4株菌株對青稞種子發芽促進作用顯著，且部分菌株可促進幼苗地下部分的生長。丁琳琳等[22]從石油污染土壤中獲得的克雷伯氏菌D 5 A菌株，產ACC脫氨酶的比活力為0.084 U·mg-1，在9%NaCl條件下可生長，pH值為4～10的LB培養基中生長良好；在含一定NaCl濃度的條件下，浸種處理可以顯著提高高羊茅種子的發芽率和芽長。本研究從貴州紅壤分離到的芽孢桿菌屬細菌菌株HGD 12，具有較高的溶磷活性，培養液的可溶磷含量可達248.04 μg·mL-1；且還可以分泌ACC脫氨酶；該菌株對于熱、酸堿及鹽濃度具有較強的抗性，在45 ℃、pH值為5.0～11.0及10%NaCl濃度下均可以生長，且7% NaCl濃度下的溶磷量仍為60.65 μg·mL-1，是一株具有抗逆促生能力的優良菌株。對辣椒和花生種子的浸種及盆栽實驗表明，HGD 12菌株顯著地促進了辣椒和花生種子的萌發，對辣椒和花生幼苗植株的鮮重、株高及根長均有顯著的促生作用，研究結果為下一步研制拌種劑應用于田間提供了功能菌株。

在利用根際促生菌菌株進行種子萌發的影響研究中，文獻報道浸泡處理的時間一般為1～4 h[21,23-26]。浸種時間過短，菌液的影響作用較弱；浸種時間過長、過高的菌液濃度，菌株自身的繁殖生長可能會消耗種子發芽時需要的足夠氧氣，反而會抑制種子的發芽[27]。在前期研究中，利用1 h的浸種處理后，發現辣椒和花生種子的萌發較對照僅略有提高；而當浸種時間延長至2 h后，發芽率明顯提高，表明不同的促生菌菌株對植物種子萌發的影響效應存在差異。

在辣椒育苗上，常規辣椒種子常因成熟度不夠、采種技術不當或貯藏方法等原因造成種子發芽率降低，苗弱且生長緩慢，進而影響其后期的生長及產量，給辣椒產業造成難以估量的經濟損失[28]。大部分的研究是利用藥劑處理辣椒種子，研究發現，利用亞精胺處理辣椒種子，并置于15 ℃低溫脅迫下萌發，可以提高種子萌發率及幼苗的生長能力[29]。張揚等的研究表明，枯草芽孢桿菌NJAU-G 10菌株具有分泌IAA和ACC脫氨酶的特性，利用該菌液添加的生物基質進行辣椒育苗，對其生長有顯著的促進作用[30]。本研究中，利用HGD 12菌株的培養液對辣椒種子進行浸種處理，有效地提高了種子活力，使得種子萌發率明顯提高，而且還促進了幼苗生長。

乙烯作為一種植物激素，廣泛地存在于植物根、莖、葉、花、果實和種子等器官和組織中。高鹽、干旱、水澇、重污染等環境脅迫會引起乙烯增加，乙烯過量產生將導致植物生長發育受阻或死亡，尤其是幼苗，乙烯可抑制根的延長、側根的生長和根毛的形成[31]。對乙烯很敏感的植物，如辣椒、番茄等，ACC脫氨酶活性均可以極大程度地促進其生長發育。有研究報道，當ACC脫氨酶活性細菌附著在種子表皮時，能通過分解ACC來調節植物內源乙烯的水平，特別是在播種后的幾天內，此種促生作用還可提高植物幼苗的成活率[32]。Li等研究表明，ACC脫氨酶活性細菌通過產生ACC脫氨酶調節乙烯水平，促進植物根伸長[33]。利用4株產ACC脫氨酶細菌懸液處理玉米和番茄種子，發現種子的生根長度較對照組均有明顯增長，番茄的穴盤栽培實驗也表明其中2株細菌可以顯著促進其株高、根長及根系活力[34]。黃蓋等[35]分離到的產氣腸桿菌ACC 30菌株分泌的ACC脫氨酶活性為0.217 U·mg-1，利用菌液培養法與菌液浸種接種法對紫花苜蓿種子進行處理，可促進其幼苗根的伸長。本研究獲得的HGD 12菌株也可分泌ACC脫氨酶，酶活性為0.27μmol·(mg·h)-1；該菌株處理的辣椒和花生幼苗的根長較對照分別增長了118.40%和56.73%，根長的顯著增長與該菌株分泌ACC脫氨酶活性也存在一定的關系。