溫度對雙島灣鰻草種子萌發的影響

(1.山東大學(威海)海洋學院， 山東 威海 264209)

鰻草(大葉藻，ZosteramarinaL.)是北半球溫帶海草的代表種[1]，鰻草海草場在近海生物多樣性的維持、水體自凈和“藍碳”儲存中發揮著重要的作用[2-3]。然而近一個世紀來，該種群在全球范圍內嚴重退化[4]，其保護和修復研究已成為海洋生態系統恢復的主要內容[5]。種子是鰻草生活史中的重要環節，實生苗對于其種群擴張及修復等有重要的作用[6]，溫度是影響其種子萌發的重要因素[7]。中國對鰻草的研究僅有十幾年歷史，對其種子萌發特性的研究也較少。本研究以威海雙島灣鰻草種子為研究對象，探究野外環境鰻草種子的萌發時間和萌發溫度以及室內低溫保存時長和萌發溫度對其萌發率和初始發時間等萌發參數的影響，以期為中國的鰻草研究以及該種群的區域保護和恢復提供參考。

1 材料與方法

1.1 種子收集

于2013年7月中旬在山東省威海市雙島灣海域(37°20.3′N，122°33.2′E)采集鰻草種子。將種子即將成熟散落的鰻草花枝裝入20目的篩絹網兜中，扎緊網兜口后直接懸于該海域，于8月下旬收集自然脫落于網袋中的種子，部分種子就地用于野外萌發試驗，剩余的就地清洗后裝于天然海水中帶回實驗室進行室內種子萌發實驗。

1.2 種子萌發

1.2.1野外種子萌發

2013年8月下旬，挑選健康、飽滿、成熟的種子，分別種植于漏底的塑料花盆內(直徑12 cm)，花盆埋于威海雙島灣東側潮間帶底泥中。每個花盆50粒種子，共27盆，花盆外部用20目的篩絹網扎好，以防種子漏出，種子種植深度為2 cm。至2014年5月間每間隔30 d取出3盆進行發芽檢驗，并測量實生苗的枝長、葉片數、葉寬、根數和根長。實驗期間用HOBO水溫測定儀(美國Onset公司生產)測定水溫。

1.2.2室內種子萌發

對帶回實驗室的種子立即進行挑選，選出健康、飽滿、成熟的種子，進行如下萌發實驗：先將種子在5 ℃天然海水(鹽度約為33‰，以下同)環境中黑暗靜置保存30 d、60 d和90 d后，轉至不同溫度梯度(5 ℃、15 ℃和25 ℃)的天然海水中進行萌發實驗。

萌發前對供試種子做如下消毒處理：用滅菌海水沖洗3～5次；70% 乙醇浸泡15 s，滅菌海水沖洗3次；20%過氧化氫浸泡20 min，滅菌海水再反復沖洗3～5次。每個處理設5次重復，每個重復30粒消毒種子，種子置于含有50 mL海水的100 mL三角瓶中，于光照培養箱(上海博訊 SPX-250 B-G型)中進行黑暗靜置培養，5 ℃處理在冰箱中進行。實驗期間，每天觀察種子萌發情況，每2 d換水1次，實驗共持續30 d。當種皮開裂、露出下胚軸和子葉時即視為發芽[8]。

1.3 數據處理

室內實驗通過每日觀察種子萌發情況來計量種子最終萌發率、初始萌發時間和萌發高峰時間。累計萌發率(%)=(實驗期間累計正常發芽種子粒數/供試種子總數)×100%；初始萌發時間為第一粒種子萌發所經歷的天數，萌發高峰時間為種子累計萌發率達到高峰時的對應天數。野外實驗每30 d統計種子萌發量，并計算種子萌發率。

統計檢驗在SPSS 17.0軟件中進行。以單因素方差分析法對自然海域不同月份間種子萌發率進行組間差異分析，以雙因素方差分析法對室內低溫保存時長和萌發溫度對種子萌發率的影響進行分析；若兩因素交互作用顯著，則對每一保存時長下不同萌發溫度間和同一萌發溫度下不同保存時長間分別進行單因素方差分析。單因素方差齊性時，采用LSD檢驗比較分析組間差異；方差不齊時，采用Dunnett’s T 3進行組間差異的多重比較。以p<0.05作為差異顯著水平，p<0.001為差異極顯著水平。數據整理和繪圖在Excel 2013軟件中完成，數據以均值±標準誤表示。

2 結 果

2.1 自然海域鰻草種子萌發特征

埋于雙島灣海域的鰻草種子在2013年9月至2014年1月期間無萌發跡象，種子從2月末開始萌發， 2月、3月、4月和5月的種子累積萌發率分別為2.1%、6.8%、14.2%和20.6%，不同月份間萌發率差異顯著，兩兩比較后，僅4月和5月間差異不顯著(圖1)。實驗期間海域日均水溫從8月13日的最高溫(27.7 ℃)降至2月10日的最低溫(-1.5 ℃)，隨后又逐漸升高至實驗結束期的17.3 ℃(5月27日)，期間日均溫低于5 ℃的累計日數為64 d。實驗期間雙島灣鰻草種子的萌發溫度范圍為4～17 ℃，2月下旬首次觀察到種子發芽時水溫為4.1 ℃，此時海域日均水溫<5 ℃、5～10 ℃、10～15 ℃、15～20 ℃和>20 ℃的累計日數分別為53 d、30 d、25 d、22 d和71 d(圖2)。可見，鰻草種子萌發前的確經歷過一個較長的高溫期和低溫期。

實生苗在2月和3月水溫較低(4～6 ℃)時僅有子葉，無真葉和根發出，枝長分別為1.3 cm和1.6 cm；4月底有根和真葉發出，且枝長顯著增加，達4.2 cm；5月底時真葉數增至2.3片，枝長和根長快速增加，分別達10.4 cm和5.4 cm，但葉片數、葉寬和根數并無顯著增加。4—5月期間實生苗開始快速生長發育時的水溫為6～17 ℃(表1)。

圖1 雙島灣海域鰻草種子的累積萌發率

圖2 雙島灣2013年8月至2014年5月日均水溫

表1 雙島灣鰻草實生苗生長發育形態特征(n=4-30)

時間枝長/cm葉片數葉寬/cm根數根長/cm2月1.3±0.1a----3月1.6±0.2a----4月4.2±1.4b1.1±0.70.11±0.12.0±0.12.6±0.2a5月10.4±0.5c2.3±0.30.14±0.93.9±0.25.4±0.6b

2.2 溫度對鰻草種子萌發的影響

5 ℃低溫保存30 d的種子僅在25 ℃條件下有萌發，但萌發率極低，僅為1.2%；低溫保存60 d和90 d后的種子在5 ℃、15 ℃和25 ℃條件下的萌發率分別為3.1%、8.7%、6.7%和8.3%、18.5%和13.6%(圖3)。雙因素方差分析表明，不同低溫保存時長和萌發溫度條件下的種子萌發率差異極顯著(p<0.001)，兩因素的交互作用也極顯著(p<0.001)。多重比較后發現，同一萌發溫度下不同低溫保存時長之間均差異顯著(p<0.05)，即低溫保存時間越長，其萌發率越高；除了低溫保存60 d后于15 ℃和25 ℃培養萌發率無明顯差別外，同一保存時長后不同萌發溫度的種子萌發率也差異顯著(p<0.05)，以萌發溫度15 ℃條件下萌發率最高(圖3)。可見，相較于萌發溫度5 ℃，其余2個萌發溫度均可有效提升種子的萌發率，但低溫保存時間較短的30 d 種子萌發率最低，而保存90 d后15 ℃條件下的萌發率最高。進一步證明較長時間的低溫保存可有效促進鰻草種子萌發，相較于5 ℃和25 ℃，15 ℃是其種子萌發的適宜溫度。

注：大寫字母代表組間差異顯著 (p<0.05), 小寫字母代表組內差異顯著 (p<0.05)。圖3 5 ℃保存30 d、60 d和90 d后在3個溫度條件下 鰻草種子的萌發率

鰻草種子的初始萌發時間和萌發高峰時間隨低溫保存時間的延長而顯著變短，低溫保存30 d后，25 ℃條件下的初始萌發時間和萌發高峰時間均為25.1 d；保存60 d后3個溫度條件下的兩指標均大于15 d；而保存90 d后3個溫度條件下的初始萌發時間和萌發高峰時間則均小于3 d和8 d(表2)。

表2 萌發溫度和低溫保存時長對鰻草種子的初始萌發時間和萌發高峰時間的影響

萌發溫度/℃保存時長/d初始萌發時間/d萌發高峰時間/d530--1530--253025.1±1.7a25.1±1.6a56018.5±3.3a20.5±1.9a156021.7±3.4a26.4±2.8a256015.5±0.3b19.4±4.4b5902.3±0.3c7.9±0.6c15902.6±0.2c4.2±0.5c25901.9±0.3c4.6±0.5c

3 討 論

溫度是影響植物種子萌發的主要生態因子之一，許多學者對鰻草種子萌發進行了野外調查和室內實驗研究，重點關注了其初始萌發溫度、萌發季節、萌發溫度范圍和最適萌發溫度等(表3)。多數自然海域的鰻草種子于秋季開始萌發，萌發期一般跨越秋末、冬、春三季，萌發期可長達2～8個月，月萌發溫度從0～20 ℃不等(表3)。加拿大Nova Scotia、韓國Jindong Bay、美國Chesapeake bay、美國Long Island和墨西哥Gulf of California 5個海域的鰻草種子初始萌發的時間(水溫)分別為：10月(11 ℃)、11月(15 ℃)、9月末10月初(約18 ℃)、9月末(15 ℃)和10月(約20 ℃)，它們的種子萌發溫度范圍(時間)分別為0～10 ℃(10—1月和4—5月)、5～15 ℃(11—3月)、3～18 ℃(10—5月)、10～13 ℃(9月末—5月)和16～20 ℃(11—12月)(表3)；相較于以上這些海域，本研究地威海雙島灣和鄰近的榮成天鵝湖的鰻草種子休眠期長達近7個月，萌發期較短(2月底—5月)，初始萌發溫度較低，僅為4 ℃。表3數據顯示，鰻草種子萌發對高溫和低溫都有明顯的規避現象，除北極圈附近外，其它海域的種子都存在夏季高溫休眠期，以度過7—8月的25 ℃左右高溫逆境，在一些冬季水溫較低的海域，如中國黃海的威海雙島灣和榮成天鵝湖以及加拿大Nova Scotia海域，冬季最低水溫低于0 ℃，鰻草種子除高溫休眠外，還有冬季低溫休眠現象，而水溫未降到0 ℃以下的海域鰻草種子則無冬季休眠現象。

表3 全球不同海域鰻草種子的萌發期和萌發溫度差異

種子來源緯度 (°N)年水溫范圍/℃ 種子成熟月份(水溫℃)水域萌發月份萌發溫度/℃最大萌發率溫度/℃文獻來源Gulf of California, 墨西哥2915.0～32.44 (21)11—1216～20—[9]Ise Bay, 日本348.1～28.0[10]———10.0[7]Ago Bay,日本348.6～27.7[11]6 (20～23)[11]——15.0[12]Jindong Bay, 韓國354.5～28.05—611—35～15—[13]天鵝湖, 中國37-1.0～26.872—55～15—[14]雙島灣, 中國37-1.5～27.76—72—54～1715.0本研究Chesapeake bay, 美國373.0～25.05—6 (22～24)10—53～185.0～10.0[15]Long Island, 美國411.0～21.0[16]79—1210～1311.5[8]Nova Scotia, 加拿大44-1.5～23.06—710—1和 4—50～10—[17]Grevelingen, 荷蘭514.0～21.0[18]———10.0[19]

雖然初始萌發溫度各海域并不一致，但最適萌發溫度卻較為相近，均在10～15 ℃范圍內。本研究與Xu等[20]和Pan等[21]的研究都證實，相較于5 ℃和25 ℃，15 ℃左右是中國黃海鰻草種子萌發的適宜溫度；本研究結果與之相符。此外日本的Ise Bay和Ago Bay海域，鰻草種子萌發的適宜溫度分別是10 ℃和15 ℃[6-7]，美國Long Island和荷蘭Grevelingen分別為11.5 ℃和10 ℃[8-19](表3)。10～15 ℃也是Setchell 經過長期多海域觀測指出的鰻草最佳營養生長的溫度范圍[22]，可見，鰻草種子的適宜萌發水溫與其實生苗生長的水溫相同。

鰻草在北半球分布廣泛，從北極圈附近的挪威海岸等海域到亞熱帶邊緣的墨西哥加利福尼亞灣，南北跨度約5 000 km，生存海域水溫差異較大，所以不同海域的鰻草種子萌發對水溫的季節變化有著不同的適應策略(表3)，表現在以種子休眠來規避低溫和高溫逆境對實生苗生長的傷害。不同海域種子初始萌發水溫和萌發溫度范圍要求不同、最適萌發溫度也略有差異，充分說明不同海域的鰻草種群在長期適應各自生存海域的水溫環境和季節變化中形成了獨特的表現型、甚至基因型，乃至在常年處于10 ℃以下低溫的格陵蘭島形成了成熟種子未萌發的適應特性[23]。不論何種形式的休眠，都是植物在長期的進化中，對于相對穩定的季節變化所形成的主動適應[24-25]。鰻草種子通過休眠，避開不利環境的迫害，在適宜溫度條件下萌發，隨后產生的幼苗在適宜溫度下生長發育，也是其種群適應逆境和保護物種延續的一種策略。有關鰻草種子休眠的機制還不太清楚，不同種群、不同生活史表現型(或不同基因型)的鰻草種子均可作為探究該種種子休眠機制的最佳材料。

本研究結果表明，低溫(5 ℃)保存可促進鰻草種子的萌發，支持了Tanner等[26]和Morita等[6]認為的鰻草種子低溫保存刺激可有效打破鰻草種子休眠的觀點，他們分別對美國Chesapeake和Ago海域的鰻草種子進行了4 ℃條件下32 d和7 ℃條件下28 d的低溫處理，大大提升了種子的萌發率，其中Ago海域春化處理組的種子萌發率可達83%(未春化處理組僅40%)。本海域種子自然條件萌發前經歷64 d的低溫，且室內萌發更是低溫保存時間越長，萌發率越高。可見，不同海域的鰻草種子可能存在不同的春化溫度和春化時長，但有關其低溫春化的溫度和時長卻尚不明確，值得進一步研究。