二倍體馬鈴薯基因編輯載體快速驗證體系的建立

(云南師范大學馬鈴薯科學研究院， 昆明 650500)

對植物的基因組進行定點編輯是研究基因功能和作物遺傳性狀改良的重要方法。CRISPR/Cas 9系統是目前最新一代的基因組編輯技術，其工作原理是核酸酶Cas 9蛋白在向導RNA(short guide RNA，sgRNA)的引導下，對目的基因進行切割，導致雙鏈斷裂，雙鏈DNA在修復時會引入堿基的插入、缺失等變異，從而實現目的基因的定點突變[1]。相比于其他基因組編輯系統，CRISPR/Cas 9系統具有構建簡單，成本低廉，易于在實驗室實現等顯著優勢，因此目前已廣泛應用于擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianabenthamiana)、水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)以及番茄(Solanumlycopersicum)[2-8]等多種植物的基因組編輯。

馬鈴薯是全球第四大糧食作物，遺傳資源豐富，其中超過70%為二倍體馬鈴薯，是馬鈴薯作物遺傳改良的珍貴資源[9]。二倍體馬鈴薯相對于四倍體基因組簡單、易于轉化，因此在二倍體馬鈴薯材料中利用基因敲除等工具驗證基因的功能更容易實現。2015年，Wang等[10]在雙單倍體DM中實現了對StIAA2的定點敲除；2017年，Andersson等[11]在四倍體馬鈴薯的原生質體中通過對StGBSS的定點突變再經過原生質體再生，獲得了富含支鏈淀粉的馬鈴薯株系；2018年，Ye等[9]通過對二倍體馬鈴薯S.tuberosumgroup Phureja S 15-65中的S-RNase的定點突變獲得了可自交的種質，這說明基因組編輯技術在馬鈴薯中的應用已經相當成熟。然而，穩定的遺傳轉化是基因功能驗證的必要手段，根癌農桿菌介導的二倍體馬鈴薯遺傳轉化耗時較長，且存在基因型帶來的顯著差異，因此建立一套快速驗證基因組編輯載體的遺傳轉化體系十分必要，不僅可以對載體的效率以及靶點的穩定性進行判斷，也為后期的穩定遺傳轉化提供有效的保證。

發根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)可以侵染植物并在受傷部位誘導產生毛狀根，也叫發狀根。發狀根具有生長迅速、周期短、多分枝等優點，因此發根農桿菌轉化系統被廣泛地應用于生產重要次生代謝產物、根發育相關基因的功能驗證及植物與微生物間的互作等領域[12]。發根農桿菌相較于根癌農桿菌對于材料的選擇較為廣泛，對于侵染的材料以及材料的基因型沒有特異性選擇。更重要的是相較于根癌農桿菌，發根農桿菌分化出發狀根的時間更短，更利于遺傳轉化后的瞬時驗證。雖然發根農桿菌侵染馬鈴薯已有報道[13]，但將CRISPR/Cas 9編輯系統應用于馬鈴薯發狀根尚未見報道。首先CRISPR/Cas 9系統在載體的設計上易出現錯誤，實驗操作中也容易出現難以察覺的堿基突變，對于載體的工作有很大影響；其次對于不同靶點編輯效率，CRISPR/Cas 9系統也有很大的差異性，而利用傳統的根癌農桿菌進行遺傳轉化不僅實驗周期慢長，遺傳轉化效率低。所以用根癌農桿菌遺傳轉化來驗證靶點的設計與分子實驗的誤差，就加大了整個實驗的工作量，延長了實驗周期。所以需要一套快速基因編輯載體檢測系統，對基因靶點的編輯效率來進行驗證，以證明CRISPR載體的適用性。馬鈴薯StCDF1(CYCLINGDOFFACTOR)是控制成熟期(熟性)的重要基因，當其和LOV藍光受體蛋白StFKF1和生物鐘核心蛋白StGI相互作用的結構域發生突變時，可促使馬鈴薯的塊莖提早形成[14]。因此，本試驗選取StCDF1作為靶基因，通過構建基于CRISPR/Cas 9系統的基因編輯載體，并利用發根農桿菌侵染馬鈴薯，建立了CRISPR/Cas 9介導的發根農桿菌遺傳轉化系統，驗證了StCDF1基因敲除載體的高效性，同時通過根瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) 穩定轉化產生了StCDF1基因編輯的植株，為后續研究StCDF1基因的調控網絡提供了寶貴的遺傳材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗所選用的所有植物材料均為二倍體材料S. tuberosum group Phureja S 15-65下文簡稱為CIP-65，從國際馬鈴薯中心引進，編號CIP 703541。發根農桿菌菌株為Ar. Qual。

1.2 試驗方法

1.2.1二倍體馬鈴薯無菌苗的培養

CIP-65采用MS 30培養基(4.43 g·L-1MS粉末+20 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂，pH=5.8)進行培養。無菌苗培養條件如下：溫度(19±1)℃，整體組培屋光照強度為2 000～3 000 lx，16 h的光照培養，8 h黑暗培養。

1.2.2馬鈴薯外植體的預培養

馬鈴薯無菌苗培養4周后，切取不帶腋芽的莖段，莖段選擇偏粗綠健壯，置于預培養基(MS 30+1.0 mg·L-1玉米素+2.0 mg·L-1奈乙酸)中進行預培養。預培養的光照條件培養溫度與無菌苗的培養條件相同。

1.2.3CRISPR/Cas 9-StCDF1載體的構建

根據測序后拼接的StCDF1基因序列，在此序列上設計了1個敲除位點。將靶點序列的5'加上ATTG，它的反向互補序列的5'加上AAAC的BsaI的酶切位點合成引物。2條sgRNA的引物分別是F:ATTGGATTCATGATCCAAATGAAG;R：AAACCTTCATTTGGATCATGAATC。所用的載體為PKSE 402，該載體包含有GFP表達元件，載體構建的方法參考文獻[15]。

注：從左到右特美汀濃度分別為0 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、6 ml·L-1圖1 生根培養基上特美汀濃度的篩選

注：a為自然光下的發狀根；b為熒光下的發狀根(白色箭頭標注的為疑似熒光根)。圖2 用熒光手電筒對轉化的發狀根進行初步篩選

1.2.4發根農桿菌的轉化和侵染

每100μL的發根農桿菌感受態加入0.05μg質粒，質粒的轉化采用凍融法。經PCR驗證的陽性菌落保存于-80 ℃冰箱中。侵染前先將菌液培養至OD=0.05，搖好的農桿菌用高速低溫離心機，轉速5 000 r·min-1，離心10 min，去上清，再用MS 20液體重懸制備成發根農桿菌侵染液。在經過48 h培養后，將預培養的莖段收集，將莖段放入侵染液，緩慢搖晃侵染的莖段，讓農桿菌與莖段接觸充分，當侵染結束后，先把菌液瀝干，將外植體置于3層無菌濾紙上吸干多余菌液。農桿菌菌液吸干后把外植體轉入加上一層無菌濾紙上的培養基中于黑暗條件下共培養2 d，置于培養箱中培養，培養溫度為28 ℃。

1.2.5發根培養基的抗性篩選

將暗培養培養了48 h的莖段收集好后，挑選40個外植體分別平均轉移至發根培養基(MS 30+特美汀)，特美汀設置了4種濃度，分別為0 mg·L-1，2 mg·L-1，4 mg·L-1，6 mg·L-1。培養溫度(19±1)℃，整體組培屋光照強度為2 000～3 000 lx，16 h的光照培養，8 h黑暗培養。

1.2.6熒光根的篩選

培養8 d后，取下發狀根放置于MS 30固體培養基的培養皿上，用熒光手電筒進行初步篩選。經過初步篩選后，將有熒光的根切下，放入MS固體培養上,再進行熒光顯微鏡的鏡檢。

2 結果與分析

2.1 生根培養基的優化

為了防止農桿菌溢出，保證發狀根的正常生長，本實驗探索了合適濃度的特美汀。共設計了4個濃度梯度，分別為0 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、6 mg·L-1。在4個培養皿內分別放置10個左右的外植體，利用相同濃度的發根農桿菌侵染外植體，侵染時間也相同的處理條件下，不同濃度的特美汀的培養皿中外植體的狀況不同。從圖1可以看出，不加特美汀的培養基上農桿菌有溢出現象，不利于發狀根的產生，而特美汀濃度過大則會抑制發狀根的生長。本實驗又采用相同的外植體，重復以上實驗，結果均是2 mg·L-1的特美汀濃度下的發狀根生長最迅速，發狀根的數量最多。因此，在本試驗體系中，2 mg·L-1的特美汀濃度既可以抑菌，也可以保證發狀根的正常生長，最快8 d即可以進行DNA的提取驗證。

2.2 基因編輯載體的驗證

為了方便篩選轉基因根，在載體中包含了綠色熒光蛋白。對轉化農桿菌的發狀根，首先用熒光手電筒進行了初步篩選(圖2)。有熒光的發狀根進一步在熒光顯微鏡下進行拍照，可以明顯的觀察到陽性根的熒光發亮程度遠大于其自發熒光(圖3)。

二倍體馬鈴薯發根農桿菌的遺傳轉化總共進行了3批，每批侵染外植體40個，每1批的40個外植體中可以篩出40條熒光根，再從每批次40條熒光根中隨機抽取10條熒光根進行測序。分析測序結果發現3次編輯的熒光根分別為7條、8條、8條，證明CRISPR/Cas 9-StCDF1載體能夠進行高效的基因編輯。測序結果驗證了熒光篩選的可靠性，說明了二倍體馬鈴薯遺傳轉化體系可以依靠熒光篩選對載體的工作效率進行快速判斷。

注：a為明場下觀察轉化陽性發狀根；b為明場下觀察轉化陰性發狀根；c為GFP 熒光通道下觀察轉化陽性發狀根；d為GFP熒光通道下觀察轉化陰性發狀根。圖3 熒光顯微鏡下對轉化的發狀根進行篩選

2.3 陽性轉基因植株的獲得

發根農桿菌體系驗證了CRISPR/Cas 9-StCDF1載體能夠工作，將該載體轉化根癌農桿菌并侵染馬鈴薯莖段。共侵染了200個莖段，經過抗生素篩選、及編輯靶點測序后，最終獲得1株雜合突變體，之后經過進一步將PCR產物回收并連接T載體測序分析，發現該突變植株為野生和缺失5 bp的雜合突變體(圖5)。

圖4 基于發根農桿菌遺傳轉化的發狀根 基因組的編輯類型

圖5 基于根癌農桿菌遺傳轉化的植株 基因組的編輯情況

3 討 論

本試驗以馬鈴薯熟性基因StCDF1為靶標，建立了二倍體馬鈴薯基因編輯載體的快速驗證辦法。該方法相較于目前主流的原生質體遺傳轉化，首先發根遺傳轉化平臺對于實驗材料的狀態要求較低，其次沒有較多的精細繁瑣的實驗操作。在操作的時間上可以快速(約8 d)判斷出編輯載體是否工作以及估算出選擇靶點的適用性。且發根農桿菌遺傳轉化平臺比原生質體轉化平臺更有優勢的是—其驗證的CRISPR載體是最終的雙元載體也就是穩定轉化的終載體，而原生質體遺傳轉化則不能，其只能檢測中間載體的工作效率，檢測后還需要進行進一步的載體改造后才能作為最終載體。為了進行高通量的篩選，建議首先使用熒光手電進行粗篩選，再將篩選到的根用熒光顯微鏡，進行仔細鑒別，排除自發熒光的干擾。此種篩選途徑，可以滿足高通量的大批陽性轉化根的篩選，又保證了篩選的準確性。

馬鈴薯原產于南美洲安第斯山脈(Andes)中部西麓、瀕臨太平洋的秘魯和玻利維亞區域，受到光周期的影響，許多馬鈴薯品種在短日照條件才能正常結薯[16]。根據之前的研究，調控開花途徑中的一些元件如光敏色素B(PHYB)、CONSTANS(CO)、FLOWERING LOCUS T(FT)、CDF轉錄因子等在馬鈴薯響應光周期變化調控塊莖形成的途徑中起著關鍵作用[16]，然而它們之間的調控網絡研究的還不是很清楚，本研究創制的StCDF1缺失5 bp的雜合突變體為研究這一科學問題提供了寶貴的材料。

此外，除了快速驗證載體，發根農桿菌系統也可被用于研究參與次生代謝產物途徑的基因。植物中數量巨大的次生代謝產物與作物的風味、營養品質等性狀密不可分，例如，馬鈴薯的塊莖在貯藏過程中易積累龍葵素，產生令人不悅的苦澀味[17]。通過CRISPR/Cas 9編輯龍葵素合成代謝途徑基因，轉化發根農桿菌，可直接檢測發狀根中代謝產物的變化，有利于快速鑒定基因的功能。