朱櫻花組培快繁技術(shù)研究

謝云巧，寧玲，李小紅，陳華飛，廖良宇，趙掛東

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南普洱 665000）

朱櫻花（Calliandra haematocephalaHassk.）又名美蕊花、紅合歡、紅絨球，豆科含羞草亞科朱櫻花屬植物，具有固氮能力、耐貧瘠、耐干旱、管理要求低、生長速度快，是綠化造林、改善土壤、改善生態(tài)環(huán)境的重要樹種；朱櫻花的葉含有大量蛋白質(zhì)，可作飼料；是紫膠蟲的寄主樹[1]；是一種可食用花卉，樹皮中含單寧，能促進消化道蠕動，改善便秘和食欲不振；具有很好的抗氧化性和抗炎作用[2]。朱櫻花的繁殖方法主要是種子繁殖和扦插繁殖。種子繁殖歷時長、處理過程繁瑣；常規(guī)扦插繁殖的插條生根困難、生根率低[3]。該試驗在有關(guān)合歡[4～10]、相思[11～14]等木本植物快繁技術(shù)的基礎(chǔ)上，研究朱櫻花組織培養(yǎng)。目前已有研究采用的外植體均來源于成年外植體進行組培，尚未見到有關(guān)采用朱花櫻種子自然萌發(fā)的幼苗的莖段作為外植體進行組培的報道。朱櫻花所采用的外植體易發(fā)生褐變，為防止褐變，筆者以自然條件下種子播種生長的籽苗莖段、幼苗莖段和嫩葉，成年植株莖段和嫩葉作外植體。應(yīng)用朱櫻花組培快繁技術(shù)有效的克服傳統(tǒng)育苗缺陷，實現(xiàn)朱櫻花的工廠化育苗、大力推廣朱櫻花種植。

1 材料與方法

1.1 外植體的選取部位

該試驗外植體分別來自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院內(nèi)3年生的朱櫻花成株以及2019年3月播種的朱櫻花幼苗。采集朱櫻花幼嫩的帶3～5個芽的莖尖、葉片、當(dāng)年春播有2～3片真葉的幼苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料的預(yù)處理

將處理好的外殖體分別用自來水沖洗2次后用低濃度洗衣粉水洗1次，自來水沖洗3次；在超凈工作臺上用 75%酒精消毒 10s，0.1%升汞消毒 5～10min后用無菌水沖洗3次。將外植體分割成0.5cm長的帶芽莖段和幼嫩的莖段后接種。以多年生嫩莖為外植體用 0.1%升汞分別消毒 8min、6min、5min，培養(yǎng)5d后進行褐化率、污染率對比。

1.2.2 試驗設(shè)計

愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)、分別采用設(shè)置10個處理、5個處理，每個處理8個重復(fù)的方法。即設(shè)置10種不同的培養(yǎng)基配方，每個配方接種8瓶，每瓶接種外植體3個。該試驗培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織、叢生芽誘導(dǎo)采用MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根采用1/2MS培養(yǎng)基。蔗糖濃度30g/L，瓊脂濃度6g/L。

1.2.3 培養(yǎng)條件

置于溫度（25±2)℃、光照強度1000～3000Lx、光照10h/d條件下培養(yǎng)。初代培養(yǎng)進行4d的暗培養(yǎng)后再進行光照培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐化率、污染率的對比試驗

由于朱櫻花所采用的外植體易發(fā)生褐變，為防止褐變，筆者以自然條件下種子播種生長的籽苗莖段、多年生幼苗莖段和嫩葉作為外植體。采用75%酒精消毒10s和1%升汞不同的消毒時間來控制褐化率和污染率。表1說明，成年植株以帶芽莖尖為外植體用75%酒精消毒10s+1%升汞消毒6min褐化率、污染率明顯減少，而籽苗表現(xiàn)良好。在75%酒精消毒10s+1%升汞消毒8min、6min褐化率、污染率均為0%。

表1 1%升汞不同消毒時間對褐化污染的影響Tab.1 Effects of mercuric chloride different sterilizing time on the browning rate and pollution rate

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

2.2.1 多年生嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)

多年生嫩莖接種30d后，進行愈傷組織統(tǒng)計。多年生嫩莖培養(yǎng)30d最佳的愈傷組織配方為BA1.5mg/L+NAA1.0mg/L，誘導(dǎo)率為87.5%。結(jié)果分析如表 2所示：

表2 多年生嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)Tab.2 Callus induction of perennial young stem

圖1 多年生嫩莖培養(yǎng)30d后產(chǎn)生的愈傷組織，愈傷組織顏色偏黃，小而緊實Fig.1 Callus produced by young perennial stems after 30 days of culture was yellowish，small and compact

圖2 多年生嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)Fig.2 Callus induction of perennial young stem

2.2.2 籽苗莖段、幼苗莖段和嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)

籽苗莖段接種15d后，進行愈傷組織統(tǒng)計。愈傷組織最佳培養(yǎng)基配方為 BA1.0mg/L+NAA2.0mg/L，誘導(dǎo)率為100%。結(jié)果分析如表 3所示：

表3 新生幼苗愈傷組織誘導(dǎo)Tab.3 Callus induction of new seedlings

圖3 籽苗培養(yǎng)15d產(chǎn)生的愈傷組織，顏色晶瑩偏綠，大而疏松Fig.3 Callus produced after 15 days of seedling culture showed a greenish,large and loose color

圖4 新生幼苗愈傷組合誘導(dǎo)Fig.4 Callus induction of new seedlings

2.3 叢生芽誘導(dǎo)

2.3.1 多年生嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)芽分化

多年生嫩莖產(chǎn)生的愈傷組織培養(yǎng)30d后沒有芽的分化，叢生芽誘導(dǎo)率為0%。結(jié)果分析如表 4所示：

表4 多年生嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)芽分化Tab.4 Callus induced bud differentiation in young perennial stems

2.3.2 幼苗愈傷組織誘導(dǎo)芽分化

在籽苗產(chǎn)生的愈傷組織的基礎(chǔ)上進行叢生芽誘導(dǎo)，培養(yǎng)30d進行發(fā)芽數(shù)統(tǒng)計，最佳培養(yǎng)基配方為BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L，誘導(dǎo)率為100%。結(jié)果分析如表5所示：

表5 新生幼苗愈傷組織誘導(dǎo)芽分化Tab.5 Callus induced bud differentiation in new seedlings

圖5 新生幼苗產(chǎn)生培養(yǎng)誘導(dǎo)的不定芽，分芽點多，小芽多Fig.5 New seedlings produced cultured adventitious buds,with more bud points and more small buds

圖6 新生幼苗愈傷組織誘導(dǎo)芽分化Fig.6 Callus induced differentiation in new seedlings

2.4 不定根誘導(dǎo)

將新生幼苗產(chǎn)生的不定芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，在NAA0.5mg/L中進行生根。

3 結(jié)論與討論

該試驗采用朱櫻花營養(yǎng)體器官即籽苗莖段，幼苗莖段和多年生春梢莖段作為研究的外植體。用籽苗和幼苗作為外植體不僅可以減少從朱櫻花未成熟種子、成熟種子中剝離幼胚進行種子繁殖這一耗費勞力的過程，而且通過朱櫻花快繁技術(shù)可以不受種子成熟程度、環(huán)境變化、天氣等自然因素的影響[15]，常年提供組培苗。就外植體的選擇，愈傷組織和叢生苗的誘導(dǎo)、以及在組培過程中褐變的處理等進行了初步的研究，結(jié)果表明：消毒方法以多年生嫩莖為外植體用75%酒精消毒10s和1%升汞消毒6min，褐化率、污染率明顯減少。篩選合適的基因型和外植體，從源頭降低酚類物質(zhì)的含量是組培褐變防治的重要手段[16～18]。朱櫻花組織培養(yǎng)以籽苗作為外植體最好，愈傷組織誘導(dǎo)率高且不會褐化。愈傷組織最佳培養(yǎng)基配方為BA1.0mg/L+NAA2.0mg/L，在籽苗產(chǎn)生的愈傷組織的基礎(chǔ)上進行叢生芽誘導(dǎo)，最佳培養(yǎng)基配方為BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L。試驗發(fā)現(xiàn)籽苗除根以外都可產(chǎn)生愈傷組織；多年生春梢莖段產(chǎn)生愈傷組織后不會再分化但愈傷組織會變得松軟、易脫落直至死亡；多年生春梢莖段褐化現(xiàn)象只存在于第一次接種，轉(zhuǎn)接后不會發(fā)生。本研究為朱櫻花后續(xù)的進一步研究提供了一定參考。