依達(dá)拉奉對(duì)腦出血大鼠血腫周圍組織細(xì)胞凋亡及P38MAPK蛋白表達(dá)的影響

劉 斌，趙紫燁，李建民，周 云，張晉霞（華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，唐山市 063000）

腦出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）后腦損傷不僅是由于血腫的占位效應(yīng)及血腫對(duì)周圍腦組織的直接破壞，繼發(fā)性腦損傷也是出血后腦損傷的主要原因。細(xì)胞凋亡在腦出血繼發(fā)性腦損傷中起重要作用[1]。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是一類重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。P38MAPK信號(hào)途徑是MAPK家族中的重要組成部分：P38MAPK通過多級(jí)激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)把細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞，傳遞至細(xì)胞核中，激活下游的激酶或多種轉(zhuǎn)錄因子從而介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生各種反應(yīng)[2]，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[3]。依達(dá)拉奉是一種新型自由基清除劑，能夠清除腦梗死周圍缺血半暗帶羥自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，從而抑制腦細(xì)胞的損傷和凋亡。依達(dá)拉奉對(duì)腦梗死的治療有一定的療效[4]，但對(duì)腦出血后血腫周圍組織細(xì)胞凋亡及P38MAPK蛋白表達(dá)變化的影響還未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腦出血模型，觀察依達(dá)拉奉對(duì)腦出血大鼠血腫周圍組織細(xì)胞凋亡及P38MAPK蛋白表達(dá)的影響，探討依達(dá)拉奉對(duì)腦出血后腦細(xì)胞的保護(hù)作用，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康♂Wistar大鼠108只，體質(zhì)量260～301 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào)：SCXK（京）-2007-0001。

1.2 試藥

Ⅶ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司，規(guī)格：1.5 kIU）；原位凋亡（TUNEL）試劑盒（福建邁新生物技術(shù)有限公司）；SP試劑盒、P38MARK多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；依達(dá)拉奉注射液（南京先聲藥業(yè)公司提供，批號(hào)：040181，規(guī)格：10 mg·5 mL－1）。

2 方法

2.1 分組

取大鼠108只，隨機(jī)分為腦出血組（48只）、依達(dá)拉奉治療組（48只）、假手術(shù)組（6只）、正常對(duì)照組（6只）。腦出血組與依達(dá)拉奉治療組再根據(jù)血腫制成后斷頭取腦的時(shí)間各分為3、6、12 h，1、2、3、5、7 d（時(shí)間點(diǎn)的選取依據(jù)腦出血的病理變化特點(diǎn)）共8個(gè)亞組，每組6只。

2.2 大鼠腦出血模型制作

術(shù)前大鼠12 h禁食，4 h禁水，以100 g·L－1水合氯醛（300 mg·kg－1）腹腔注射麻醉，保證手術(shù)期間大鼠有自主呼吸。然后參照Rosenberg等[4]的方法，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》[5]，將膠原酶（在生理pH和溫度下，該化合物具有水解天然膠原蛋白的作用）注入到大鼠蒼白球誘導(dǎo)腦出血模型。確定蒼白球位置為前囟后1.4 mm，中線向右旁3.2 mm，深度為5.6 mm。腦出血組及依達(dá)拉奉治療組向蒼白球緩慢注入2 μL含0.4 IUⅦ型膠原酶的生理鹽水，假手術(shù)組注入2 μL滅菌生理鹽水，4 min注射完畢，留針5 min后緩慢將針退出，骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合皮膚。正常對(duì)照組不作任何處理。

2.3 給藥方法

依達(dá)拉奉治療組于腦出血后2 h腹腔內(nèi)注射依達(dá)拉奉3 mg·kg－1（取量依據(jù)：根據(jù)依達(dá)拉奉使用說明書及文獻(xiàn)報(bào)道確定[6]），每天1次，用藥到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。假手術(shù)組和腦出血組給與等量生理鹽水。

2.4 組織切片制備

在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)麻醉大鼠，以生理鹽水和4%多聚甲醛灌注固定后斷頭取腦，以血腫為中心按冠狀位切取血腫周圍2 mm的腦組織，置于上述灌注液中固定24 h以上。常規(guī)石蠟包埋腦組織，分別做5 μm連續(xù)切片備用。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用TUNEL法。具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下細(xì)胞核呈棕黃色者為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。

2.6 P38MAPK蛋白檢測(cè)

采用免疫組化SP法，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下P38MAPK蛋白以細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色著色為陽(yáng)性細(xì)胞。

2.7 圖像分析

高倍鏡下隨機(jī)觀察腦出血血腫周圍腦組織不重疊的6個(gè)視野，采用高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)TUNEL檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)和P38MAPK免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以Excel數(shù)據(jù)庫(kù)整理后用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組間同一時(shí)間點(diǎn)的比較采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)，同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用方差分析，兩指標(biāo)間相關(guān)性用簡(jiǎn)單相關(guān)及直線回歸分析，以P＜0.05為差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

正常對(duì)照組未見凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，假手術(shù)組術(shù)后48 h僅于針道周圍偶見凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，因數(shù)量極少故未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。腦出血組和依達(dá)拉奉治療組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡數(shù)結(jié)果見表1。

表1 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠血腫周圍組織細(xì)胞凋亡數(shù)比較（個(gè)，，n＝6）Tab1 Comparison of amount of apoptotic cells in perihematoma region of rats between two groups at different time points（piece，，n＝6）

表1 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠血腫周圍組織細(xì)胞凋亡數(shù)比較（個(gè)，，n＝6）Tab1 Comparison of amount of apoptotic cells in perihematoma region of rats between two groups at different time points（piece，，n＝6）

注：方差分析，腦出血組F＝486.928，P＜0.01；依達(dá)拉奉治療組F＝312.908，P＜0.01；同組內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)比較：△P＜0.01；依達(dá)拉奉治療組與同時(shí)間點(diǎn)腦出血組比較：▲P＜0.01note：variance analysis：in ICH group F＝486.928，P＜0.01；in edaravone treatment group F＝312.908，P＜0.01；the former time point vs.the later time point in the same group：△P＜0.01；edaravone treatment group vs.ICH group at the same time point：▲P＜0.01

由表1可見，腦出血組大鼠腦出血3 h后腦出血灶周已出現(xiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，出血后6 h開始明顯增加，于出血后2～3 d達(dá)到高峰，到出血后3 d凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量開始下降。依達(dá)拉奉治療組大鼠腦出血后3 h也可見凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，并隨腦出血時(shí)間延長(zhǎng)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增加，于腦出血后2～3 d達(dá)到高峰，3 d后開始下降。與腦出血組相比，依達(dá)拉奉治療組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞于腦出血后3 h未見明顯降低（P＞0.05），于腦出血后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 數(shù)量均有降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3.2 P38MAPK蛋白檢測(cè)結(jié)果

正常對(duì)照組及假手術(shù)組均可見少量P38MAPK蛋白表達(dá)。腦出血組和依達(dá)拉奉治療組不同時(shí)間點(diǎn)P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較結(jié)果見表2。

由表2可見，大鼠腦出血后3 h出血腫周圍區(qū)P38MAPK蛋白陽(yáng)性細(xì)胞開始增加，其分布區(qū)域與凋亡細(xì)胞相同，包括膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞。隨腦出血時(shí)間延長(zhǎng)，P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，腦出血后6 h開始明顯增加，于腦出血后12 h～1 d達(dá)高峰，之后開始逐漸下降。依達(dá)拉奉治療組大鼠腦出血后3 h也可見P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞開始增加，并隨出血時(shí)間延長(zhǎng)P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多，于出血后12 h～1 d達(dá)到高峰，之后開始逐漸下降。與腦出血組相比，依達(dá)拉奉治療組P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞于出血后3 h未見明顯降低（P＞0.05），于腦出血后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d數(shù)量均有降低，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠血腫周圍組織P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)，，n＝6）Tab 2 Comparison of amount of P38MAPK positive cells in perihematoma region of rats between two groups at different time points（piece，，n＝6）

表2 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠血腫周圍組織P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)，，n＝6）Tab 2 Comparison of amount of P38MAPK positive cells in perihematoma region of rats between two groups at different time points（piece，，n＝6）

注：方差分析，腦出血組F＝367.194，P＜0.01；依達(dá)拉奉治療組F＝246.744，P＜0.01；同組內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)比較：△P＜0.01；依達(dá)拉奉治療組與同時(shí)間點(diǎn)腦出血組比較：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01note：variance analysis：in ICH group F＝367.194，P＜0.01；in edaravone treatment group F＝246.744，P＜0.01；the former time point vs.the later time point in the same group：△P＜0.01；edaravone treatment group vs.ICH group at the same time point：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

時(shí)間3 h 6 h 12 h 1 d 2 d 3 d 5 d 7 d依達(dá)拉奉治療組33.56±2.3643.09±2.81▲△49.13±3.40▲▲△59.69±3.03▲▲△51.27±3.71▲▲△44.67±3.13▲▲△38.37±2.85▲▲△32.93±2.63▲▲△腦出血組34.16±2.2747.31±2.68△55.92±3.32△68.43±3.97△59.04±3.44△52.92±2.91△46.52±2.64△41.16±2.51△

4 討論

依達(dá)拉奉是目前臨床試驗(yàn)證明唯一有效的自由基清除劑[7]。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，相對(duì)分子量為174.20，是一種具有親脂性基團(tuán)的化合物，在體內(nèi)以陰離子形式存在，并可轉(zhuǎn)移1個(gè)電子給自由基而產(chǎn)生依達(dá)拉奉基團(tuán)，阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[8]。筆者的研究結(jié)果顯示，腦出血后血腫周圍組織存在細(xì)胞凋亡；與腦出血組相比，依達(dá)拉奉治療組于腦出血后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d及7 d血腫周圍組織細(xì)胞凋亡表達(dá)均減少。表明依達(dá)拉奉可抑制腦出血后血腫周圍組織的細(xì)胞凋亡，對(duì)出血后腦組織起到神經(jīng)保護(hù)作用。

研究[9]發(fā)現(xiàn)，P38MAPK信號(hào)通路參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及細(xì)胞間功能同步等多種生理過程，并與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)。筆者在本實(shí)驗(yàn)中觀察到，大鼠腦出血后3 h即可見P38MAPK蛋白的表達(dá)，表達(dá)高峰出現(xiàn)在腦出血后1 d，于2 d后開始下降，而正常對(duì)照組和假手術(shù)組P38MAPK蛋白均為低表達(dá)。與腦出血組相比，依達(dá)拉奉治療組p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞于出血后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d及7 d數(shù)量均有降低。說明依達(dá)拉奉治療組與腦出血組之間在P38MAPK蛋白的表達(dá)上存在明顯的變化差異，依達(dá)拉奉降低了P38MAPK蛋白的表達(dá)，說明依達(dá)拉奉能抑制P38MAPK蛋白的表達(dá)。

筆者還發(fā)現(xiàn)，P38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于腦出血血腫周圍受損傷的膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元，與凋亡細(xì)胞分布區(qū)域一致，且依達(dá)拉奉能抑制P38MAPK蛋白的表達(dá)與抑制腦出血后血腫周圍組織的細(xì)胞凋亡的表達(dá)結(jié)果是一致的。因此，本研究結(jié)果表明，依達(dá)拉奉抑制細(xì)胞凋亡可能通過下調(diào)促凋亡相關(guān)P38MAPK蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，但其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

[1]張 云，劉 斌.腦出血后繼發(fā)性腦損傷的細(xì)胞凋亡機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（12）：1130.

[2]Ferrer I，F(xiàn)riguls B，Dalfo E，et al.Early modification in the expression of mitogen-activated protein kinases（MAPKERK），stress-activeted kinases SAPKJNK and p38，and their phosphorylated substrates following focal cerebral ischemia[J].Acta Neuropathol（Berl），2003，105（5）：425.

[3]Hans J S，Michael J W.Mitogen-activated protein kinases：specific messages from ubiguitious messsngers[J].Mol Cell Biol，1999，19（4）：2435.

[4]Deinsberger W，Vogel J，Kuschinsky W，et al.Experimental intracerebral hemorrhage：description of a double injection model in rats[J].Neurol Res，1996，18（5）：475.

[5]包新民，舒斯云.大鼠立體定位圖譜[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：35～36.

[6]Watanabe K，Hayase T.Radical scavenging mechanisms of MCI-186[J].Jpn Pharmacol Ther，1997，25（2）：189.

[7]王擁軍.腦卒中神經(jīng)保護(hù)劑治療的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)療前沿，2007，2（3）：85.

[8]Masahiro B，Tetsuya M，Hideki K，et al.The radical scavenger edaravone prevents oxidative neurotoxicity induced by peroxynitrite and activated microglia[J].Neuropharm，2005，4（3）：283.

[9]Ma XL，Kumars，Gao F，et al.Inhibition of p38 mitogenactivated protein kinase decrease cardiomyocyte apoptosis and impresses cardiac function after myocardial ischemia and reperfusion[J].Circulation，1999，99（13）：1685.