透明帶激光操作對玻璃化凍融囊胚復蘇及孵出動態模式的影響

薛林濤，王世凱，覃捷，李政達，周亭亭，毛獻寶，張小慧，韋娉嬪，劉慶友，譚衛紅*

(1.廣西壯族自治區人民醫院生殖醫學與遺傳中心，南寧 530021；2.廣西大學亞熱帶生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004)

隨著囊胚培養體系的不斷完善及玻璃化冷凍技術的成功應用，玻璃化凍融囊胚移植在體外受精治療周期中已成為一種常規技術。為了提高囊胚玻璃化凍融復蘇效果及胚胎種植效率，許多研究采用在玻璃化冷凍前后對囊胚進行透明帶激光操作，這主要包括冷凍前激光人工皺縮(Artificial shrinking，AS)和解凍后激光輔助孵化(Artificial hatching，AH)，但是由于缺乏大規模隨機臨床對照試驗證據支撐，囊胚透明帶操作的臨床應用仍然存在爭議[1]。而時差胚胎培養監測技術(Time-lapse)的出現可以實現對胚胎體外發育全程進行動態監測，獲取胚胎發育生理事件發生時間點和動態模式的量化數據，在胚胎發育研究方面具有獨特優勢[2]。本研究選擇體外受精周期病人的剩余囊胚，采用隨機對照試驗，利用Time-lapse系統監測不同透明帶激光操作方式對玻璃化凍融囊胚復蘇后的孵出模式和動態發育參數的影響，探討透明帶激光操作在囊胚玻璃化凍融周期中的應用價值和安全性。

資料與方法

一、研究對象

本研究所用胚胎均來源于2017年4月至2018年6月在廣西壯族自治區人民醫院生殖醫學與遺傳中心接受體外受精治療患者移植或冷凍后的剩余囊胚。研究所用囊胚評級方法參照Gardner囊胚分級法[3]。

囊胚入選標準為：受精方式為體外受精，且冷凍前囊胚透明帶完整；受精后第6天囊胚；囊胚分期為3期和4期；囊胚內細胞團和滋養層評級均≥C級。

囊胚排除標準為：冷凍前囊胚腔發生自然皺縮；冷凍過程中除本研究分組設計的激光人工皺縮操作外，其他原因導致囊胚透明帶破損者。

獲所有患者知情同意并簽署科研知情同意書，且通過倫理委員會批準(KYZC-2015-01)。

二、研究方法

1.試驗分組：囊胚冷凍前隨機分為人工皺縮組(AS組，接受激光人工皺縮后冷凍)和未人工皺縮組(NAS組，直接冷凍)兩組；每組囊胚解凍后再隨機分為輔助孵化組(AH組，激光輔助孵化)和未輔助孵化組(NAH組，直接培養)兩個亞組。因而，本研究中囊胚共分為4組，即AS+AH組、AS+NAH組、NAS+AH組和NAS+NAH組。采用隨機數字表法隨機分組。

2.囊胚玻璃化冷凍及解凍：囊胚玻璃化冷凍及解凍均采用COOK玻璃化冷凍解凍試劑盒(K-SIBV/W-5000，COOK，澳大利亞)。所有試劑使用前預熱平衡至37℃，具體操作過程參見文獻[4]。冷凍載體為HSV封閉式載桿(025250，Cry Bio System，法國)，每個載桿均放置一個囊胚。

3.囊胚激光人工皺縮及輔助孵化：囊胚透明帶激光操作采用OCTAX激光破膜儀(OCTAX，MTG，德國)。囊胚冷凍前將其放置于激光專用物鏡下，打開激光發射器的鎖定水平位，將其放置在囊胚內細胞團對側滋養層細胞連接處，調節激光發射時間給予單次激光打孔，而后放置于37℃、6%CO2培養箱培養10 min，待囊胚腔完全皺縮后進行玻璃化冷凍；囊胚解凍后立即進行激光輔助孵化，選擇透明帶間隙較大或碎片較多處作為孵化部位，激光溶解約1/4透明帶，而后清洗換液移入時差培養皿繼續培養。

4.囊胚時差培養監測：囊胚解凍后移入預先配制的9孔Primo Vision時差培養皿(16606，Vitrolife，丹麥)，其中加入37℃、6%CO2平衡過夜的囊胚培養液，而后放入Primo Vision(Primo Vision Evo，Vitrolife，匈牙利)時差胚胎監測系統培養48 h，培養環境為37℃、6%CO2、5%O2。培養箱內預先安裝好Primo Vision時差系統鏡頭并連接Analyzer圖像分析軟件，設置圖像拍攝間隔頻率為5 min，7個等距焦平面掃描間隔頻率為60 min。

5.觀察指標：采用Time-lapse監測解凍囊胚發育進程，所有動態發育參數時間點判定由同一名經驗豐富的專業技術人員完成。解凍囊胚繼續培養后囊胚腔重新擴張且充滿透明帶判定為囊胚復蘇成功，該時間點判定為囊胚復張時間；囊胚細胞從透明帶開始外溢判定為囊胚孵出，該時間點判定為囊胚孵出開始時間；囊胚細胞完全擺脫透明帶整體從透明帶中溢出判定為囊胚完全孵出，該時間點判定為囊胚完全孵出時間；囊胚細胞從透明帶缺口溢出但未使缺口擴大，在透明帶內外兩側形成8字型囊胚腔判定為8字型孵出；囊胚腔作為一個整體從透明帶缺口呈U型溢出判定為U型孵出；囊胚培養過程中成腔囊胚腔液自然釋放皺縮成無腔囊胚判定為囊腔回縮，一次囊腔皺縮并重新擴張周期判定為一次囊腔回縮。具體見圖1。

A：皺縮囊胚；B：復張囊胚；C：激光人工皺縮囊胚(紅色箭頭示透明帶開孔)；D：8字型孵出囊胚；E：激光輔助孵化皺縮囊胚(綠色箭頭示透明帶開孔)；F：囊胚開始孵出；G：U型孵出囊胚；H：完全孵出囊胚

三、統計學處理

結 果

本研究共納入212個囊胚，根據分組方法隨機分為AS+AH組、AS+NAH組、NAS+AH組、NAS+NAH組共計4個亞組，每組各53個囊胚。3期囊胚占比分別為5.66%(3/53)、9.43%(5/53)、5.66%(3/53)、9.43%(5/53)，組間差異無統計學意義(P>0.05)。

一、透明帶激光操作對玻璃化凍融囊胚復蘇效率及孵出模式的影響

AS+AH組及AS+NAH組囊胚解凍后復蘇率顯著高于NAS+AH組及NAS+NAH組(P<0.05)，而AS+AH組與AS+NAH組、NAS+AH組與NAS+NAH組亞組間囊胚解凍后復蘇率無顯著差異(P>0.05)；NAS+NAH組的孵出率顯著低于其余3組(P<0.05)。在孵出模式的對比中，與AS+AH組相比，AS+NAH組和NAS+NAH組的完全孵出率及U型孵出率均顯著下降，而8字型孵出率顯著升高(P均<0.05)，但NAS+AH組各指標與之無統計學差異(P>0.05)；NAS+AH和NAS+NAH組在孵出率、完全孵出率及U型孵出率上有顯著差異，后者較前者顯著下降(P<0.05)(表1)。

二、透明帶激光操作對玻璃化凍融囊胚孵出動態參數的影響

4組囊胚解凍后復張時間無顯著差異(P>0.05)；NAS+NAH組囊胚孵出開始時間顯著晚于其他3組(P<0.05)；AS+NAH組及NAS+NAH組囊胚完全孵出時間顯著晚于AS+AH組與NAS+AH組(P<0.05)；AS+AH組與NAS+AH組囊腔回縮次數顯著少于AS+NAH組及NAS+NAH組(P<0.05)(表2)。

表1 透明帶激光操作對玻璃化凍融囊胚復蘇及孵出模式的影響(%)

注：與AS+AH組比較，*P<0.05；與AS+NAH比較，#P<0.05；與NAS+AH組比較，&P<0.05

表2 透明帶激光操作對玻璃化凍融囊胚發育及孵出動態參數的影響(-±s)

注：與NAS+NAH組比較，*P<0.05；與AS+NAH組比較，#P<0.05

討 論

玻璃化冷凍是目前囊胚凍存的常規技術，其通過高濃度的冷凍保護劑使胚胎細胞充分脫水，在快速降溫過程中細胞內水分子由液相直接轉變為固態玻璃相，從而避免冷凍過程中冰晶形成所造成的細胞損傷。玻璃化冷凍技術在臨床的成功應用顯著提高了囊胚凍融的效率。但是也有研究提出，囊胚腔液的存在導致囊胚冷凍過程中無法充分脫水，其殘留的水分子致使降溫過程中冰晶形成，是凍融囊胚細胞損傷的主要風險[5]，而采用人工皺縮方式在囊胚冷凍前釋放腔內液體，可顯著提高囊胚玻璃化凍融的臨床效率[6]，同時由于激光脈沖操作簡單快速，激光人工皺縮在臨床上應用最為廣泛[7]。本研究通過隨機對照試驗比較了激光人工皺縮對囊胚玻璃化凍融復蘇效果的影響，結果顯示冷凍前進行激光人工皺縮的囊胚凍融后復蘇率顯著高于未皺縮囊胚(83.02% vs.54.72%，P=0.003；88.68% vs.64.15%，P=0.005)；同時，對于解凍后未行輔助孵化的囊胚，人工皺縮組的囊胚孵出開始時間顯著早于未皺縮組[(445.86±423.62) vs.(732.75±448.45)min，P=0.026)，囊胚孵出率也顯著高于未皺縮組(74.47% vs.23.53%，x2=20.55，P<0.001)，這說明囊胚冷凍前通過人工皺縮方式使囊胚腔液充分釋放，有助于最大程度減少胚胎內殘存水分子，降低玻璃化凍融過程中冰晶形成的風險，提高凍融囊胚發育潛力。

透明帶是卵母細胞外周由糖蛋白構成的嗜酸性膜，其在早期胚胎發育過程中起到營養通道和保護屏障的重要作用，但是囊胚形成后適時從透明帶中孵出是胚胎宮內種植的關鍵生理事件，早期研究發現胚胎冷凍過程會造成透明帶硬化從而導致囊胚孵出困難[8]，而人工輔助孵化可以降低囊胚孵出能量消耗閾值，從而有利于囊胚完成孵出，但是目前人工輔助孵化在臨床中的應用仍存爭議。有研究認為解凍囊胚進行人工輔助孵化可以獲得更高的臨床妊娠率[9]，尤其對于形態評級較低或者受精后第6天形成的囊胚，輔助孵化能夠顯著提高其種植效率[10]，同時也有研究認為輔助孵化無助于解凍囊胚移植周期臨床結局改善，美國生殖醫學協會關于輔助孵化在輔助生殖周期應用的共識僅將其列為C級證據[11]，中華醫學會生殖醫學分會人類體外受精-胚胎移植實驗室操作專家共識也不推薦所有移植胚胎進行輔助孵出[12]。究其原因，目前關于輔助孵化是否適宜主要依據的是臨床試驗數據，而影響胚胎種植的混雜因素眾多，需要大樣本量設計嚴格的試驗以明確單個因素的真實影響，而目前尚缺乏相關研究結果報道；同時，由于臨床試驗研究中的研究指標多為臨床妊娠率及種植率等，而無法對囊胚宮腔內移植后的發育過程進行追蹤及量化分析。因此，有研究提出應用Time-lapse對囊胚解凍后體外的發育進程進行動態追蹤，可以獲取囊胚發育及孵化相關的更為詳細直觀的實驗數據[13]，在研究透明帶操作對囊胚發育影響方面更具優勢。Goto等[14]通過Time-lapse監測小鼠囊胚體外發育發現，透明帶輔助孵化的小鼠囊胚孵出時間顯著早于透明帶完整囊胚；Ueno等[15]研究發現采用激光部分去除或者完全去除透明帶的人體外受精周期解凍囊胚，其完全孵出率顯著高于透明帶完整囊胚，同時囊胚在纖連蛋白涂層培養皿中的體外粘附實驗結果顯示，完全去除透明帶的囊胚發生粘附時間和細胞增殖擴展速率顯著快于透明帶部分去除或透明帶完整囊胚。本研究結果也顯示解凍囊胚進行激光輔助孵化后囊胚孵出率和完全孵出率顯著提高，同時囊胚的孵出開始時間和完全孵出時間也顯著早于未輔助孵化囊胚；另外還發現輔助孵化囊胚的囊腔回縮次數顯著少于未輔助孵化囊胚，這說明透明帶輔助孵化降低了囊胚孵出所需要的能量閾值，提高了囊胚孵出的速度和效率，有利于囊胚順利擺脫透明帶束縛從而進入胚胎植入階段。

囊胚透明帶操作雖然在提高冷凍復蘇和孵出效率上具有優勢，但是也存在一定風險。目前臨床最具爭議的是單卵雙胎的發生，尤其對于冷凍前激光人工皺縮囊胚，激光在透明帶上的細小開孔會人為制造囊胚孵出突破點，理論上會導致囊胚8字型孵出模式風險增加，而囊胚8字型孵出過程中內細胞團易受到硬化透明帶嵌頓發生內細胞團分離，這是單卵雙胎形成的最主要機制[16]。本研究通過Time-lapse監測解凍囊胚孵出的動態模式結果也顯示，冷凍前激光人工皺縮的囊胚如果解凍后不進行人工輔助孵化，囊胚8字型孵出率顯著增高，這也證實了以上假設；同時本研究結果也提示解凍后透明帶輔助孵化能夠顯著改變囊胚孵出模式，輔助孵化組的囊胚8字型孵出率顯著下降，囊胚孵出模式主要呈U型孵出。另外本研究也發現8字型孵出囊胚的完全孵出率顯著下降，Time-lapse動態監測視頻顯示該類型囊胚細胞大多從透明帶開孔溢出，而通過囊胚腔回縮復張使透明帶變薄和開孔增大的能力顯著減弱，從而導致囊胚無法完全孵出，尤其對于質量較差或凍融過程細胞受損的囊胚，發生此類風險的機率更高，而此類囊胚在與子宮內膜識別黏附過程中由于透明帶的影響勢必降低種植能力。因此，解凍囊胚特別是冷凍前人工皺縮囊胚進行輔助孵化有利于囊胚正常孵出。

綜上所述，激光人工皺縮能夠提高囊胚玻璃化凍融復蘇效率，但是人工皺縮導致的透明帶開孔增加了解凍囊胚孵出異常的風險，而激光輔助孵化可以改善囊胚孵出效率，有助于囊胚正常孵出，因此激光人工皺縮聯合激光輔助孵化可以常規應用于囊胚玻璃化凍融周期，在改善囊胚復蘇及孵出結局上具有一定價值。