影響早期胚胎發育的精子因素

周建騰，馬慧，張貝貝，史慶華

(中國科學技術大學附一院生殖與遺傳分院 合肥微尺度物質科學國家研究中心，合肥 230027)

早期胚胎發育是一個復雜而又調控精細的過程，其異常可能導致胚胎停育、妊娠率低下、流產、死胎、早產、出生缺陷和新生兒死亡等。早期研究發現，胚胎發育主要受母源因素的調控[1-2]。但是越來越多的證據表明，精子作為高度特化的細胞類型，除了為胚胎提供父源基因組外，還參與了生殖過程中的多個生物學事件，如精卵融合、卵裂以及胚胎發育的表觀調控等[3-4]。精子攜帶的遺傳物質和表觀遺傳信息異常可能通過影響早期胚胎的發育而影響體外受精(IVF)結局[5](圖1)。本文對精子中影響早期胚胎發育的遺傳及表觀遺傳因素及其作用機制進行了文獻綜述。

DNA甲基化模式在生殖細胞發育階段建立；減數分裂I和II期間可能發生染色體分離異常而導致非整倍體；在精子發生的最后階段即圓形精細胞變態形成精子的過程中，魚精蛋白替代和中心體可能出現異常；DNA碎片化則主要發生于精子中。在精子發生的整個過程中，都可能發生DNA雙鏈斷裂及修復障礙、組蛋白修飾異常和非編碼RNA豐度異常(圖1)。

圖1 精子發生過程中遺傳和表觀遺傳異常來源

一、父源遺傳因素對早期胚胎發育的影響

1.精子染色體異常對早期胚胎發育的影響：無論減數分裂I還是減數分裂II染色體分離錯誤都會導致精子染色體數目異常(非整倍體)。盡管染色體非整倍精子的發生率很低，但其一旦與卵子受精后，都可能導致胚胎停育、流產、死胎等不良妊娠結局或先天出生缺陷等嚴重后果[6-7]。利用熒光原位雜交(FISH)可以檢測精子的染色體組成[8]。研究發現，在大頭畸形、多核、多鞭毛精子以及嚴重的少精子患者的精子中，非整倍體的發生率顯著升高[9-10]。因此，在進行輔助生殖時，對精子尤其是形態異常精子或來自嚴重少精子癥患者的精子進行染色體組成分析是必要的。另外，針對精子染色體數目異常比例偏高的夫婦，應當告知其發生流產以及后代染色體異常的風險較高。

2.精子DNA損傷對早期胚胎發育的影響：精子中的DNA損傷可能源自精子發生和成熟的不同階段，主要類型包括DNA單鏈切口或雙鏈斷裂[11]。導致精子DNA損傷的因素可能有氧化應激以及精細胞變形染色質重塑時DNA斷裂修復異常。氧化應激過程中會產生大量活性氧，而精子中轉錄失活以及細胞質很少則會導致其抗氧化活力和DNA損傷修復能力不足，進而導致DNA損傷，因此精子極易由于氧化應激產生DNA損傷[12-13]。另外，精子變形時，絕大多數組蛋白會被魚精蛋白替代并形成高度濃縮的染色質，魚精蛋白比例異常也會導致精子DNA損傷的增加，表明魚精蛋白對于保持精子DNA的完整具有重要意義[14]。

檢測精子DNA損傷的方法很多，如精子染色質結構分析(SCSA)、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)和單細胞電泳(Comet)分析等。研究表明，接受輔助生殖治療的夫婦，其精子DNA損傷程度與妊娠率呈負相關[15]，與自發性流產[16]和體外培養時胚胎不能發育至胚泡階段的比例呈正相關[17]。Schulz等[18]研究發現，來源于DNA損傷程度較高精子的胚胎往往在6～8細胞階段發生停滯。另外，對24對復發性自發流產的夫婦進行的研究發現，其精子DNA損傷程度顯著高于對照人群[16]。

盡管這些研究表明精子DNA損傷與胚胎發育密切相關，但目前尚不清楚導致胚胎發育異常的精子DNA損傷的閾值。確定不影響胚胎發育正常進行的精子DNA損傷閾值，將有助于對精子質量進行評估，并通過精子選擇技術，挑選DNA損傷水平低于閾值的精子用于輔助生殖，從而提高輔助生殖成功率，降低輔助生殖技術導致后代異常的風險。

二、父源表觀遺傳因素對早期胚胎發育的影響

由于精子獨特的功能需求，其表觀修飾高度特化。在精子發生過程中，染色質上的絕大多數組蛋白被魚精蛋白替換，形成包裝緊密的精子頭部，并保護精子攜帶的DNA不被雌性生殖道環境破壞；而未被魚精蛋白替換的組蛋白則可以發生不同的化學修飾。此外，精子DNA則保持高度甲基化狀態。這些表觀修飾共同構成了精子獨特的表觀修飾狀態。有證據表明，來自精子的多種不同形式的表觀遺傳信息對于哺乳動物早期胚胎的正常發育是必需的，這些修飾包括：(1)DNA甲基化；(2)組蛋白修飾；(3)染色質高級結構包裝；(4)精子來源的非編碼RNA(ncRNAs)。

1.精子DNA甲基化對早期胚胎發育的影響：DNA甲基化是一種重要的基因表達調控方式，它參與了基因組印記、X染色體沉默、基因的時空表達調控以及防御外源性遺傳物質入侵等多個過程。啟動子區域DNA甲基化水平的改變可以激活或者抑制基因轉錄。啟動子區域的高甲基化可以阻止啟動子與轉錄因子的結合，從而抑制這些基因表達。相反，低甲基化則可增加RNA聚合酶與DNA結合，從而促進基因的轉錄。

在小鼠和人等哺乳動物的生命周期中，存在兩次全基因組范圍的去甲基化[19]。一次是在原始生殖細胞發育過程中，全基因組中包括印記基因在內的大部分基因都發生去甲基化，抹去父母來源的印記而恢復發育多能性；另一次是在受精卵著床前早期胚胎發育過程中，即高度特化的精子和卵子，經去甲基化產生具有多能性的胚胎干細胞。著床后，早期胚胎的基因組會重新發生甲基化。

值得注意的是，受精后父源和母源基因組去甲基化是不同步的，并且父母的配子中基因組特定的區域如印記基因不會發生去甲基化，因此父源或者母源基因組甲基化水平異常可能是部分受精卵沒有明顯異常但著床失敗的原因。Benchaib等[20]發現在IVF患者中，精子DNA低甲基化(<555 AU)與低妊娠率相關(8.3%，正常組33.3%)。在另外一項研究中，Kelly等[21]使用去甲基化劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理來降低小鼠精子DNA的甲基化水平，發現小鼠妊娠率顯著下降，植入前胚胎停育比例升高。同時，DNA甲基化模式的改變也會導致印記基因表達異常，進而誘發早期胚胎發育障礙及胚胎畸形等[22]。相關研究表明，超過一半的Beckwith-Wiedeman綜合征和大約10%的Angelman綜合征的發生都與表觀遺傳缺陷有關[23]。

上述研究表明，精子DNA甲基化修飾水平對于早期胚胎發育具有重要意義，不合適的DNA甲基化會導致妊娠率下降或早期胚胎發育異常。因此，明確精子DNA甲基化和胚胎發育之間的聯系，將有助于對早期胚胎發育異常相關疾病的預防和診治。

2.精子組蛋白修飾對早期胚胎發育的影響：雄配子最獨特的表觀遺傳特征之一是魚精蛋白替換了組蛋白，形成高度凝集的細胞核結構，以保護其DNA不被破壞，同時維持精子的運動能力。但是，精子染色體的部分區域(1%～10%)仍保留了組蛋白及其修飾[24]。研究表明這些組蛋白保留區域不是隨機分布的，而是顯著富集在發育相關的位點，包括印記基因簇、小RNA簇、HOX基因簇和分散分布的發育相關轉錄調控因子啟動子區域[25-26]。理論上，精子中的這種組蛋白及其修飾的選擇性保留可以允許胚胎發育過程中特定靶基因的激活或沉默，從而調控早期胚胎發育。研究確實發現，精子中H3K4me2和H3K4me3富集的基因與胚胎發育過程密切相關，H3K27me3則富集在早期胚胎發育過程中沉默基因的啟動子附近[24]。在另外一項研究中，Hammoud等[26]還發現，在導致IVF早期胚胎停育的不育男性精子中，組蛋白保留區域是隨機分布的，不同于可育人群精子中保留組蛋白的分布。同時他們還發現，這些不育男性精子中與發育相關基因的H3K4me和H3K27me富集程度明顯下降。這些研究表明，精子組蛋白表觀遺傳修飾在早期胚胎發育中具有重要作用，隨著我們對精子中組蛋白及其修飾的認識的增加，將有望對男性因素所致不孕癥在表觀遺傳學水平進行分類、診斷和治療。

3.精子染色質高級結構對早期胚胎發育的影響：精子細胞核中染色質高級結構可能是表觀遺傳調控的一種方式。在精子發生過程中，魚精蛋白會以逐步替換的方式取代染色質組蛋白(H2A、H2B、H3和H4)，最終產生高度凝縮且轉錄沉默的染色質。圓形精細胞的染色質結構與體細胞的相似，在隨后的精子成熟過程中，染色體組蛋白被高度乙酰化，并逐步被轉換蛋白(TP1和TP2)替換；在精子變態的最后階段，轉換蛋白又被魚精蛋白取代[27]。魚精蛋白對DNA的緊密包裝可以保護精子DNA免受內源和外源因子如核酸酶、自由基或誘變劑等的破壞作用[28]。精子特異的魚精蛋白有兩種，即魚精蛋白1(P1)和魚精蛋白2(P2)，越來越多的證據表明，P1和P2的比例可影響男性生育能力[29]。已知正常生育人群的P1/P2比率接近0.9[30]，正常范圍為0.8到1.2[31]。P1/P2比率偏離這個范圍的個體表現為精子功能低下，體外輔助生殖妊娠率較低，但不影響ICSI 后的妊娠率。這些結果提示，P1/P2比例的改變可能與受精過程的早期事件相關，例如精子的獲能、頂體反應、質膜融合或穿透透明帶等[32-33]。未來的工作中，需要進一步確定精子染色質包裝異常對早期胚胎發育的確切影響。

4.精子來源的ncRNAs對早期胚胎發育的影響：成熟精子中存在多種不同類型的ncRNAs(non-coding RNAs)，包括miRNAs、PIWI-interacting RNAs(piRNAs)、tRNA-derived small RNA(tsRNAs)、mitochondrial genome-encoded small RNAs(mitosRNAs)和long ncRNAs(lncRNAs)。精子在睪丸中產生以及運輸至附睪并在附睪中成熟的過程中，ncRNAs的類型和比例發生了劇烈的變化，主要表現為piRNAs的含量下降、tsRNAs的含量急劇增加[34-38]。這些非編碼RNAs可以由精子攜帶進入卵母細胞，影響受精和早期胚胎發育。人們曾認為，與含有大量母源mRNA的卵母細胞相比，這些殘留的精子ncRNAs數量太少，不可能是受精和胚胎早期發育的關鍵參與者[39]。然而，最近的研究表明，在早期胚胎發育過程中，精子帶來的ncRNAs確實具有生物學功能[40-42]。因此，精子來源的ncRNAs被認為是從父親傳遞給胚胎的另一種形式的表觀遺傳信息。

2016年，Chen等[43]發現精子tsRNAs可作為記憶載體將獲得性狀跨代傳遞。他們將高熱量飲食處理的雄性小鼠精子的總RNAs或者tsRNAs注射入合子中，并對得到的早期胚胎及后代的胰島進行RNA測序，發現代謝相關基因的表達顯著下調。這表明精子來源的RNAs確實在早期胚胎發育過程中發揮作用。2018年，另一個研究組探索了精子成熟前后的RNA在植入前胚胎發育中的作用[4]。他們分別利用從附睪頭部和附睪尾部來源的精子進行ICSI，獲得了受精卵和胚胎，并考察了這些胚胎的發育情況。結果顯示，使用附睪頭部精子產生的胚胎在整個胚胎植入前發育過程中過度表達多種調節因子，胚胎植入率低，而且植入后胚胎快速失活。值得注意的是，在上述受精卵中，顯微注射純化后的附睪尾部特異性小RNA，不僅降低了相關調節因子的表達，還降低了植入后胚胎死亡率。這些發現說明小RNA在哺乳動物植入前胚胎發育過程中具有重要作用[4]。此外，Yuan等[41]利用Dicer和Drosha條件性敲除(cKO)小鼠獲得miRNA或endo-siRNA部分缺失的精子，并考察miRNA和endo-siRNA在受精以及植入前胚胎發育中的作用。結果顯示，miRNAs和endo-siRNAs譜異常的精子通過ICSI產生的胚胎，其早期發育能力降低；而注射來自正常精子的RNAs則可恢復胚胎的發育潛能。這些結果不僅表明精子攜帶的RNA對受精卵和植入前胚胎的發育十分重要，還提示注射正常精子來源的RNA可能是一種提高輔助生殖技術成功率的新方法。

三、精子中心體對早期胚胎發育的影響

精子的中心體是一種高度特化的細胞器，在精子成熟以及哺乳動物的胚胎發育過程中發揮重要作用[44]。在精子發生早期，與體細胞類似，精母細胞的中心體由相互垂直的兩個中心粒及其附近的基質組成。精子變形過程中，遠端的中心粒開始組裝微管而形成精子尾部，并在精子成熟后被降解，而近端中心粒得以保留。但在卵子發生過程中，中心體則經歷了完全不同的變化，卵母細胞的中心體在進入減數分裂時消失。因此，受精后，精子來源的中心粒進行復制形成正確的中心體結構，這一現象被稱為中心體的不對稱遺傳[45]。在人類胚胎發育過程中，受精、受精卵的染色體分離和細胞分裂都依賴于精子來源的中心體[46]。

由中心體受損或缺乏的精子產生的胚胎可能表現出不同程度的發育異常。Rawe等[47]發現使用中心體形態異常或形成星狀體能力下降的精子進行IVF，受精卵無法形成原核。Palermo等[44]發現，中心體不成熟可能會導致胚胎發生染色體嵌合的比例升高。使用睪丸來源的圓形精細胞獲得的胚胎，發生染色體嵌合的比例高達53%，幾乎是使用成熟精子獲得的胚胎染色體嵌合比例(26.5%)的兩倍。進一步研究發現，染色體嵌合比例的增加主要是受精卵第一次分裂時染色體分離異常導致的，而受精卵第一次分裂時染色體的分離依賴精子來源的中心體。因此，可能是睪丸來源的未成熟精子中心體功能缺陷，導致了早期胚胎有絲分裂染色體分裂異常。

盡管精子的中心體對于早期胚胎有絲分裂染色體的分離是必需的，但卵母細胞中也可能存在相應的補償機制。冷凍可能會影響精子中包括中心體在內的蛋白質的功能，但是Liu等[48]使用冷凍后的兔子精子，利用卵細胞胞漿注射技術成功得到了后代。另一項研究中，研究人員以豬為研究模型，去除精子尾部，使用卵細胞胞漿注射技術成功得到了后代[49]，而去除尾部的精子是不包含中心體的。在這些研究中，缺少中心體的合子能進行正常有絲分裂并發育成健康的個體，目前有兩種不同的猜想[50]：一是由于卵母細胞中的中心體成分組裝形成具有功能的紡錘體；二是卵母細胞合成了中心體相關蛋白、完成了中心體的從頭組裝。高等哺乳動物為什么對中心體采用不對稱遺傳發生，精子中心體異常是否以及如何影響早期胚胎發育等，都有待進一步闡明。

四、總結

精子除了為胚胎提供父源的基因組外，還參與調控受精、早期胚胎發育等生物學過程。因此，進行輔助生殖時，需要全面評估精子的質量[51]。首先，精子單倍體基因組的完整性對成功生殖十分重要，使用基因組存在缺陷的精子進行輔助生殖，可能會導致妊娠率和胚胎植入率降低、胚胎發育停滯和自發流產率升高等不良妊娠結局。另外，越來越多的研究表明，精子攜帶的表觀遺傳信息在早期胚胎發育中也發揮著重要作用。精子DNA甲基化、組蛋白替換或/和修飾可以調控靶基因的表達，進而影響早期胚胎發育進程。精子染色質的高級結構不僅起到保護精子DNA的作用，還可能與受精過程如精子的獲能、頂體反應、穿透透明帶等相關，精子來源的中心體則可能影響早期卵裂，而精子攜帶的ncRNAs對早期胚胎發育的作用已逐漸明確[41]。

值得指出的是，現階段對于精子因素與早期胚胎發育關系的研究還處于起步階段，使用新技術、新策略和合理的實驗方案來探討精子的遺傳和表觀遺傳缺陷與胚胎發生異常之間的關系十分必要[52-53]。首先，需要對男性不育患者進行分類，明確患者精子的遺傳、表觀遺傳參數，確定胚胎發育狀況，才能建立精子因素和胚胎發育間的直接關系。其次，還應深入探討導致精子遺傳和表觀遺傳異常的原因和機制。已有研究表明，環境因素和衰老是導致精子表觀遺傳異常的重要原因。Quintanilla-Vega等[54]報道，鉛通過與魚精蛋白2結合而影響精子染色體壓縮。Yauk等[55]發現空氣污染與小鼠精子的DNA甲基化水平升高有關。此外，人們也發現年齡對精子遺傳物質和表觀遺傳信息有影響，Flatscher-Bader等[56]發現老年雄性小鼠的后代中拷貝數變異相對年輕小鼠的后代更常見，年老雄性的后代發生發育異常的比例有所升高。對衰老是否導致精子表觀遺傳改變仍然存在爭議，但有研究表明來自老年精子的胚胎期基因表達水平等存在異常[57-58]。

總之，精子在早期胚胎發育過程中發揮了重要的作用，其遺傳和表觀遺傳異常都可能導致妊娠率低下、胚胎發育障礙等嚴重問題。隨著對精子和早期胚胎發育關系的研究的逐漸深入，我們可以更全面、更深入地認識哪些精子因素會影響以及如何影響早期胚胎發育，揭示精子遺傳和表觀遺傳異常發生的原因和機制，為男性因素所致不育的預防、診斷和治療，提供新思路。