10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR診斷念珠菌病感染的準(zhǔn)確性研究

婁海芳　張喬冶　許歡　吳飛

[摘要] 目的 探討10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR診斷念珠菌病感染的準(zhǔn)確性研究，找到一種簡(jiǎn)單、快速、有效的臨床用來(lái)診斷口腔念珠菌病的方法。 方法 于2014年1月～2017年1月期間在我院口腔科患者中選取患有口腔念珠菌病的患者100例，收集患者唾液（或含漱液）標(biāo)本和口腔黏膜脫落細(xì)胞，10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR法用于檢測(cè)標(biāo)本中白色念珠菌，比較兩種檢測(cè)方法的診斷效能（靈敏度、特異度、ROC面積及預(yù)測(cè)值等）。結(jié)果 與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測(cè)念球菌的準(zhǔn)確性更高（P<0.05）。與10%KOH涂片鏡檢的結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測(cè)念球菌的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值更高（P<0.05）。與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測(cè)念球菌的ROC面積值更高（P<0.05）。 結(jié)論 10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR診斷念珠菌病感染的準(zhǔn)確性較高，Real-time PCR診斷效果更好，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值，可快速檢測(cè)和診斷口腔念珠菌病。

[關(guān)鍵詞] 10%KOH涂片鏡檢;Real-time PCR;念珠菌病;診斷效能

[中圖分類號(hào)] R644? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）22-0035-04

[Abstract] Objective To investigate the accuracy of 10%KOH smear microscopy and Real-time PCR in the diagnosis of candidiasis infection， and to find a simple， rapid and effective method for the diagnosis of oral candidiasis. Methods 100 patients with oral candidiasis were selected from the dental patients in our hospital from January 2014 to January 2017. The saliva（or gargle） specimens and oral mucosal exfoliated cells were collected for the purpose of detecting candida albicans of specimens. 10% KOH smear microscopy and Real-time PCR were applied to diagnose efficiencies（sensitivity， specificity， ROC area， Yoden index， and predicted values） of the two assays were calculated. Results The accuracy of detection of candida albicans by Real-time PCR was higher than that of the 10%KOH smear microscopy（P<0.05）. Compared with the results of smear microscopy with 10%KOH， the sensitivity， specificity， positive predictive value， and negative predictive value of candida albicans by Real-time PCR were higher（P<0.05）. Compared with the results of smear microscopy with 10%KOH， the ROC area of candida albicans by Real-time PCR assay was higher（P<0.05）. Conclusion The accuracy of 10%KOH smear microscopy and Real-time PCR for the diagnosis of candidiasis is high. Real-time PCR has a better diagnostic effect and has high clinical value. It can rapidly detect and diagnose oral candidiasis.

[Key words] 10%KOH smear microscopy; Real-time PCR; Candidiasis; Diagnostic efficacy

最近的研究發(fā)現(xiàn)，條件致病性真菌感染越來(lái)越得到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，尤其是深部真菌病，其發(fā)病率和死亡率日益升高，威脅著患者的健康和生命。白色念珠菌（candidiasis） 是一種真菌，經(jīng)常出現(xiàn)在人體內(nèi)部，包括口腔、上呼吸道、腸道和陰道內(nèi)，其數(shù)量在健康的體內(nèi)不多，所以不會(huì)引發(fā)疾病，但是如果免疫功能下降或者正常菌群功能失調(diào)時(shí)，機(jī)體就會(huì)被真菌所感染，同時(shí)真菌還會(huì)在體液中釋放代謝物，其會(huì)被作為抗原導(dǎo)致免疫反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生特異性抗體，特異性抗體快速繁殖，生長(zhǎng)形式也改變?yōu)檠可z相，在入侵細(xì)胞后會(huì)造成疾病。念珠菌不耐熱，在60℃環(huán)境下1 h就會(huì)死亡。白色念珠菌常寄居于正常體內(nèi)，當(dāng)機(jī)體免疫機(jī)能持續(xù)降低或體內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境已經(jīng)失調(diào)，極易引起機(jī)體患有念珠菌病。念珠菌在不同位置時(shí)可引發(fā)不同的疾病[1，2]。

念珠菌的數(shù)量與機(jī)體內(nèi)的平衡共生狀態(tài)被破壞時(shí)，念珠菌會(huì)變?yōu)榫z相，而不是原來(lái)的圓形或卵圓形，從而導(dǎo)致其在局部快速大量的繁殖，由于近年來(lái)大量的免疫抑制劑及抗生素的濫用導(dǎo)致體內(nèi)正常的菌群出現(xiàn)失調(diào)，因此白色念珠菌在臨床檢查中呈現(xiàn)感染率和發(fā)病率上升的趨勢(shì)[3，4]。由于念珠菌的感染初期，患者的癥狀不明顯，臨床表現(xiàn)亦缺乏明顯的特征性，導(dǎo)致念珠菌的臨床早期診斷率很低，可明顯影響患者的預(yù)后。

口腔念珠菌病是臨床上一種常見的多發(fā)性口腔疾病，常規(guī)的臨床診斷主要依靠患者的癥狀和體征，輔以血培養(yǎng)和組織病理檢查檢出假菌絲和大量芽孢，提示念珠菌經(jīng)實(shí)驗(yàn)室的細(xì)菌檢查證實(shí)感染[5，6]。常規(guī)檢查方法雖然具有操作簡(jiǎn)單、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，但是該方法耗時(shí)較長(zhǎng)、敏感性較低，容易造成假陰性而出現(xiàn)臨床漏診，會(huì)導(dǎo)致患者因病情延誤而最終治療失敗[7，8]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，Real-time PCR法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、快捷方便，已逐步開始用于真菌病的診斷和研究[9]。本研究擬采用10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR法來(lái)實(shí)現(xiàn)臨床診斷口腔念珠菌病的感染情況的研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2017年1月于我院口腔科確診為口腔念珠菌病患者100例作為觀察組，診斷金標(biāo)準(zhǔn)：①均為口腔念珠菌感染;②真菌培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果為陽(yáng)性念珠菌感染;③2名專家一起給予臨床確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：30 d內(nèi)接受過(guò)抗真菌治療或口腔局部治療者;妊娠期或哺乳期女性;不能配合試驗(yàn)者。觀察組男44例，女56例;平均發(fā)病年齡（59.68±11.35）歲;偽膜型念珠菌病14例，紅斑型念珠菌病75例，增殖型念珠菌病11例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集及實(shí)驗(yàn)室處理? ①采集口腔黏膜病損區(qū)的脫落細(xì)胞：在病損區(qū)，采用一次性壓舌板反復(fù)涂刮少許黏膜脫落細(xì)胞10 次，留取2 mL唾液，12 000 r/min離心 10 min，吸取 50 μL沉淀及上清液混勻后制成口腔黏膜涂片，并收集黏膜標(biāo)本采集DNA。②唾液（或含漱液）采集：剩余唾液（或含漱液）進(jìn)行下一步的真菌培養(yǎng)鑒定，沙保氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行定量檢測(cè);法國(guó)科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行定性檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)方法及結(jié)果判讀? ①10%KOH 涂片鏡檢：采用 10%KOH 溶液消化法處理載玻片，菌絲或芽生孢子出現(xiàn)明顯的折光性判讀為陽(yáng)性。②Real-time PCR法：按 DNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取念珠菌 DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。檢出DNA擴(kuò)增即為陽(yáng)性。評(píng)價(jià)指標(biāo)包括診斷試驗(yàn)的真實(shí)性（靈敏度、特異度、預(yù)測(cè)值等）及受試者工作特征曲線（ROC）下面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)量資料滿足方差齊性和正態(tài)分布，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)與Kappa 檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較脫落細(xì)胞和唾液標(biāo)本與兩種檢測(cè)方法組合的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 10%KOH鏡檢和Real-time PCR法檢測(cè)結(jié)果

10%KOH涂片鏡檢的脫落細(xì)胞陽(yáng)性結(jié)果為58%（58/100），10%KOH涂片鏡檢唾液（或含漱液）的陽(yáng)性結(jié)果為34%（34/100）。Real-time PCR法檢測(cè)的脫落細(xì)胞陽(yáng)性結(jié)果為92%（92/100），Real-time PCR法檢測(cè)的唾液（或含漱液）陽(yáng)性結(jié)果為96%（96/100）。與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測(cè)念球菌的準(zhǔn)確性更高（P<0.05）。見表1。

2.2 10%KOH鏡檢和Real-time PCR法檢測(cè)的真實(shí)性評(píng)價(jià)

10%KOH鏡檢和Real-time PCR法檢測(cè)方法的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值結(jié)果見表2、3。與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測(cè)念球菌的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值更高（P<0.05）。

2.3 ROC曲線評(píng)價(jià)10%KOH鏡檢和Real-time PCR法

見表4。與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測(cè)念球菌的ROC面積值更高（P<0.05）。

3 討論

在國(guó)內(nèi)外的診斷中，根據(jù)臨床癥狀及體征結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查診斷口腔念珠菌病雖已經(jīng)得到廣泛認(rèn)同，但仍缺乏統(tǒng)一的國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)[10，11]。菌絲（假菌絲、真菌絲）或芽生孢子確診時(shí)，利用涂片鏡檢或唾液培養(yǎng)等方法的耗時(shí)較長(zhǎng)，且敏感性較低，所以致力于尋求一種及時(shí)、高效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法有利于念球菌的臨床確診和治療措施的實(shí)施[12，13]。本研究結(jié)果顯示，10%KOH涂片鏡檢脫落細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)果為58%（58/100），唾液（或含漱液）陽(yáng)性結(jié)果為34%（34/100）。脫落細(xì)胞Real-time PCR法檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果為92%（92/100），唾液（或含漱液）Real-time PCR法檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果為96%（96/100）。與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測(cè)念球菌的準(zhǔn)確性更高。主要由于脫落細(xì)胞10% KOH 涂片鏡檢觀察對(duì)象與背景反差小，尤其是唾液（或含漱液）標(biāo)本在離心處理后，會(huì)導(dǎo)致載玻片內(nèi)的細(xì)胞增多，增大了觀察假菌絲和芽生孢子的難度，10% KOH涂片鏡檢靈敏度最高，但實(shí)驗(yàn)室檢查的特異度較低，極易受到唾液（含漱液）沉淀標(biāo)本等因素干擾[14，15]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR法可以檢測(cè)出微量的真菌DNA，己成為真菌檢測(cè)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。Real-time PCR法，即實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的方法，其敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、快捷方便，同時(shí)還能夠克服普通PCR不能準(zhǔn)確定量、容易污染等的不足。由于其操作簡(jiǎn)單、快速方便、靈敏度高、污染率低等特點(diǎn)，近年來(lái)已經(jīng)逐步開始應(yīng)用于真菌病的診斷和研究[16，17]。本研究用DNA 提取試劑盒提取白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及兩株臨床分離菌株的 DNA，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)的分子量進(jìn)行試驗(yàn)觀察比較，將白色念珠菌DNA 擴(kuò)增出 500 bp 左右的特異性條帶，檢測(cè)出 1×100個(gè)/mL的白色念珠菌。本研究結(jié)果表明，與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測(cè)念球菌的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值更高;與10%KOH涂片鏡檢結(jié)果相比，Real-time PCR法檢測(cè)念球菌的ROC面積值更高（P<0.05），從 DNA提取到 PCR 擴(kuò)增的全部過(guò)程中，提取白色念珠菌只需 6 h，縮短實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行血培養(yǎng)和組織病理檢查的時(shí)間，有效提高了臨床的診斷時(shí)效，說(shuō)明Real-time PCR法檢測(cè)念球菌診斷試驗(yàn)的臨床應(yīng)用價(jià)值最高，為疾病的治療爭(zhēng)取時(shí)間[18]。此種方法在檢測(cè)樣本中白色念珠菌的敏感度高、特異性強(qiáng)、可行性好、結(jié)果穩(wěn)定，具有快速、方便、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可以為白色念珠菌感染的早期診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[19，20]。Real-time PCR檢測(cè)法只能鑒定 6 種常見念珠菌以及檢測(cè)白色念珠菌耐藥基因突變。

本研究在嚴(yán)謹(jǐn)觀察和實(shí)驗(yàn)室診斷的基礎(chǔ)上，由兩名專家共同確認(rèn)白色念珠菌的診斷，以確定其感染和非感染的情況。在最大程度上控制了臨床診斷白色念珠菌的漏診和誤診，可更好評(píng)價(jià)臨床診斷試驗(yàn)的可靠性。同時(shí)采用雙盲法，判讀人員對(duì)標(biāo)本和研究對(duì)象的臨床表現(xiàn)、分組等相關(guān)信息完全不知曉，最大程度上避免了人為偏差，確保試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。本研究結(jié)果提示，10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR診斷念珠菌病感染的準(zhǔn)確性較高，Real-time PCR診斷效果更好，臨床應(yīng)用價(jià)值高，可作為口腔念珠菌病診斷的治療和干預(yù)的快速檢測(cè)法，其臨床應(yīng)用前景十分良好。但是本研究無(wú)法鑒定出來(lái)具體的菌種，并且對(duì)于免疫力低下、抗真菌治療效果不佳的患者尚需進(jìn)一步的組織病理學(xué)檢查。

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（收稿日期：2019-01-14）