茯苓多糖對人乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移的影響及機制

胡康 羅清 朱曉峰 程曉明 馮國麗 劉正蕓 孫素紅

(遵義醫學院 1附屬醫院甲乳外科，貴州 遵義 563000；2附屬醫院腫瘤研究室；3醫學與生物學研究中心)

乳腺癌是全球女性腫瘤死亡率最高的癌癥之一。目前手術切除、放療、化療、放療及分子靶向治療等是針對乳腺癌治療的主要手段〔1〕。在這些診療手段中，臨床發現部分藥物有明顯的毒副作用，且患者易對其產生耐藥性〔2〕。特異富含AT序列結合蛋白(SATB)-1是一種組織特異性核基質結合蛋白，在乳腺癌病理切片及乳腺癌細胞株中均可以檢測到SATB-1過表達，提示SATB-1可能是乳腺細胞癌變的關鍵蛋白，在乳腺癌侵襲轉移中起到決定性作用〔3〕。Kohwi-Shigematsu等〔4〕在檢測相關基因圖譜發現，SATB-1可以通過調節近1 000個基因來促進腫瘤的侵襲轉移，提示其在乳腺癌發生的不同階段起到重要作用。前期研究篩選發現茯苓中多糖類成分具有抑制MDA-MB-231細胞遷移作用。茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf屬于為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，傳統上用于治療水腫尿少，痰飲眩悸，脾虛食少，便溏泄瀉，心神不安，驚悸失眠，在《本草正》《本草綱目》和《神農本草經》均有相關記載〔5〕。研究顯示，茯苓的主要化學成分為多糖類化合物，其包括茯苓糖、β-茯苓聚糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、硬烷和纖維素等〔6〕。本實驗探索茯苓多糖(PPS)抑制MDA-MB-231細胞遷移活性，并分析其對SATB-1基因調控的作用機制及潛在的抗癌藥用價值。

1 材料和儀器

1.1材料 茯苓5.0 kg(產地安徽)購自上海康橋中藥飲片有限公司，陰離子交換樹脂(DEAE Sepharose Fast Flow)和分子篩凝膠柱(Superdex-75)購自GE Healthcare；普魯蘭多糖P-82標準品套裝購自Shodex；單糖標準品和三氟乙酸(TFA)購自西格瑪公司，氯化鈉和乙醇購自國藥集團；其他試劑均為分析純。人乳腺癌MDA-MB-231細胞株購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，L-15 培養基購自Hyclone公司，TRIzol購自Invitrogen公司，Transwell小室購自康寧，細胞計數試劑盒(CCK)-8購自寶生物，胰酶和胎牛血清購自Gibco公司。

1.2儀器 高效液相色譜儀(HPLC)為安捷倫1100系列，配備示差折光檢測器(RI)；GC/MS色譜儀為安捷倫7890B型GC/7693型三重四級桿質譜儀(GC-TQTMMS)，TRACE TR-5毛細管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)購自賽默飛公司；多糖分離系統配置RI檢測器購自利穗科技；電子天平購自賽托利斯；冷凍干燥機購自LABCONCO；酶標儀購自Molecular Device，熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀為ABI7900系列購自美國ABI。

1.3PPS提取及分離純化 PPS的提取和分離過程參見本課題組已發表文獻〔7〕，活性最強洗脫組分PPS10經Superdex75分子篩凝膠柱層析，得PPS10-2。

1.4多糖純度和相對分子量測定 參考文獻〔7〕方法，采用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)法測定低聚糖的純度及相對分子量。

1.5單糖組成分析 參考文獻〔8〕方法，采用還原水解法進行糖組成分析。

1.6細胞活力檢測 人乳腺癌MDA-MB-231細胞株用含有10%胎牛血清(FBS)的L-15培養基在37℃含5% CO2的培養條件下正常培養。待細胞達到90%融合時，按5×104/孔的細胞密度接種于96孔板，細胞繼續培養24 h后，分別加入不同濃度的茯苓樣品處理20 h，然后用CCK-8于490 nm處測量吸光度并計算細胞活力。

1.7細胞遷移實驗 人乳腺癌MDA-MB-231細胞株用含有10% FBS的L-15培養基在37℃含5% CO2的培養條件下正常培養。待細胞達到90%融合時，消化細胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗一次，用無血清培養基重懸細胞并計數，在transwell各孔上室分別加入200 μl細胞懸液，其細胞密度為1.5×105/孔。在下室加入500 μl含10%FBS的培養基后，將小室置于培養箱中繼續培養20 h。取出transwell小室，用PBS緩慢洗滌3次，用甲醇固定10 min后隨即用2%結晶紫染色15 min，在鏡下觀察時隨機選取5個高倍鏡下視野進行拍照和計數。

1.8SATB-1基因表達實驗 人乳腺癌MDA-MB-231細胞株用含有10% FBS的L-15培養基在37℃含5% CO2的培養條件下正常培養。待細胞達到90%融合時，消化細胞并將其按照2×105/孔密度接種于12孔板，細胞繼續培養24 h后，分別加入不同濃度的茯苓樣品處理20 h，用TRIzol法提取總RNA，然后用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測SATB-1基因表達。引物設計序列為：SATB-1正義：AACGAGCAGGAATCTCCCAGGCG；反義：ACCAGTGGGTACGCGATGA。 GAPDH正義：GATGAGATTGGCATGGCTTT；反義：CAGAAGTGGGGTGGCTT。

1.9統計方法 采用t檢驗。

2 結 果

2.1PPS對MDA-MB-231細胞活力的影響 不同濃度PPS處理MDA-MB-231人乳腺癌細胞株24 h后，細胞活力〔(104.0±3.8)%、(106.0±3.6)%、(109.4±6.2)%〕沒有受到影響(P>0.05)，空白對照組細胞活力為〔(100.0±3.0)%〕；表明PPS在50，100和200 mg/L沒有明顯細胞毒性。

2.2PPS對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響 100和200 mg/L的PPS處理細胞20 h后，對MDA-MB-231細胞遷移均有較強的抑制作用，每視野細胞遷移數分別為(54±21)、(46±7)個，與空白對照組〔(377±79)個〕差異顯著(P<0.05)。見圖1。

圖1 PPS對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響(結晶紫染色，×100)

2.3PPS的分離純化 茯苓樣品經DEAE Sepharose Fast Flow分別以H2O、0.1、0.2、0.5和1.0 mmol/L NaCl洗脫分離后，被依次分為5個部分PPSW、PPS1、PPS2、PPS5和PPS10；活性跟蹤檢測獲得最強部位PPS10，再經Superdex75純化，獲得多糖PPS10-2。

2.4PPS10-2的純度和分子量測定 PPS-10-2的HPGPC呈單一峰(圖2)，表明PPS10-2為均一多糖。經HPGPC法檢測和Cirrus GPC軟件分析測得PPS10-2相對平均分子量為5 761 D。

2.5單糖組成分析 PPS10-2主要含鼠李糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖=10∶3.3∶7.0(圖3)。

2.6PPS10-2對MDA-MB-231細胞活力的影響 不同濃度(50，100，200 mg/L)PPS10-2處理24 h后，細胞活力〔(112.3±3.9)%、(105.5±3.9)%、(102.7±3.7)%〕沒有受到影響(P>0.05)，空白對照組為(100.0%±6.1%)；表明PPS10-2在50，100和200 mg/L不同濃度下對MDA-MB-231細胞無毒性。

圖2 PPS10-2的HPGCP圖譜

A.PPS10-2；B．單糖混合對照品，1．D-鼠李糖，2.L-巖藻糖，3.D-阿拉伯糖，4.D-木糖，5.D-甘露糖，6.D-葡萄糖，7.D-半乳糖圖3 PPS10-2單糖組成分析氣相色譜

2.7PPS10-2對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響 細胞處理20 h后，100 mg/L PPS10-2對MDA-MB-231細胞遷移〔每視野遷移細胞數為(55±8)個〕均有較強的抑制作用，與空白對照組〔(303±15)個〕差異顯著(P<0.05)(圖4)。

2.8PPS10-2對SATB-1基因的調控 經100 mg/L的PPS10-2處理細胞20 h后對SATB-1抑制作用明顯，SATB-1表達量為0.6，空白對照組為1.0，兩組差異顯著(P<0.05)。表明PPS10-2可能是通過抑制SATB-1基因來抑制MDA-MB-231細胞遷移。

圖4 PPS10-2對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響(結晶紫染色，×100)

3 討 論

SATB-1是一種組織特異性表達的核基質序列特異性結合蛋白，與腫瘤的侵襲遷移密切相關。通過調控SATB-1可以對腫瘤相關目標基因進行調控，從而進一步調節細胞分化和凋亡，從而影響腫瘤細胞的發展和轉移。SATB-1在乳腺癌患者組織中有高表達，然而在正常組織中沒有表達〔9，10〕。敲除SATB-1基因后可以發現其可以逆轉乳腺癌癌細胞的表型，對于腫瘤的發生、增殖和轉移有一定的抑制作用。乳腺癌中SATB-1可以通過直接上調腫瘤相關基因和下調腫瘤抑制基因從而對腫瘤的發生，轉移及預后起宏觀調控的作用〔4，11〕。多種基因可以參與和調控腫瘤的轉移機制，這一復雜過程主要包括原發灶分離、浸潤血管和淋巴及內皮細胞黏附、分解基質、外滲，導致血管生成并逃避抗腫瘤免疫應答，最終在轉移部位生長〔12～14〕。本實驗結果表明PPS和PPS10-2在檢測的最高濃度200 mg/L時對細胞沒有明顯的毒性作用。其次，在處理高侵襲性乳腺癌細胞MDA-MB-231后，乳腺癌細胞的遷移被顯著抑制，結果顯示PPS和均一多糖PPS10-2能顯著降低其體外遷移的能力。PPS及均一多糖PPS10-2可能是通過抑制SATB-1來降低MDA-MB-231細胞的體外遷移能力，由此闡明PPS中可能是均一多糖PPS10-2成分通過下調SATB-1來抑制MDA-MB-231細胞遷移作用，從而抑制乳腺癌細胞的轉移。