失荅剌知丸及其拆方對腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)JNK蛋白表達的影響

王娜琳 賈孟輝2，3* 左艷麗2 馮佳婷 馬玉瑋

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，寧夏 銀川 750001；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004

腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)是指腦組織缺血性卒中發(fā)生時經(jīng)過機械或化學(xué)治療后，腦血管血流重建而引起的損傷[1]，其損傷的主要形式是神經(jīng)細胞的凋亡，臨床以神經(jīng)功能損傷為主要癥狀。JNK即應(yīng)激活化蛋白激酶(stress activated kinase,SAPK),是MAPK家族的主要成員之一[2]。研究表明，JNK信號通路與細胞凋亡過程密切相關(guān)[3]，其可促進大鼠腦缺血再灌注海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡[4]。本課題組前期研究已證實，失荅剌知丸可改善CIRI大鼠神經(jīng)功能損傷癥狀，促進神經(jīng)干細胞增殖，抑制神經(jīng)細胞凋亡[5-7]。腦缺血再灌注模型是最接近人類腦梗死的理想大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型[8]。因此，本實驗通過對失荅剌知丸及其拆方對腦缺血再灌注模型大鼠JNK信號通路的影響觀察，以進一步探討失荅剌知丸原方組成及各部分不同效果。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 本實驗動物由寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(寧)2015-0001。用SPF級體重為(230±20)g的SD雄性大鼠102只。大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后，按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(A組，6只)，正常組(B組，6只)，模型組(D組，18只)，干預(yù)組：包括失荅剌知丸組(E組，18只)、拆方Ⅰ組(C組，18只)、拆方Ⅱ組(F組，18只)、拆方Ⅲ組(G組，18只)。模型及各干預(yù)組按時間點不同又分別分為1 d、3 d、7 d組。

1.2 藥物 失荅剌知丸：柴胡31 g，黑訶子31 g，撒額冰(阿魏)9 g，蘆薈62 g，白芥子9 g，失荅剌知(血根草)6 g，沙哈木罕荅里(藥西瓜)9 g，胡椒3 g，安息香9 g，巴豆霜9 g，菖蒲6 g，番鹽6 g，阿里公(松蕈)9 g，干姜9 g，蓽撥9 g，蕓香9 g(《回回藥方》原配方比例折算成公制克，藥物劑量換算依據(jù)：一兩約等于16.5克)。

拆方Ⅰ組：巴豆霜9 g；拆方Ⅱ組：巴豆霜9 g，柴胡31 g，黑訶子31 g，蘆薈62 g；拆方Ⅲ組：巴豆霜9 g，撒額冰(阿魏)9 g，白芥子9 g，失荅剌知(血根草)6 g，沙哈木罕荅里(藥西瓜)9 g，胡椒3 g，安息香9 g，菖蒲6 g，番鹽6 g，阿里公(松蕈)9 g，干姜9 g，蓽撥9 g，蕓香9 g。

藥物由寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供，上各方按傳統(tǒng)煎煮法煎煮并濃縮，濃縮藥物濃度為4.5 g/mL。

1.3 造模 模型組及各干預(yù)組采用改良的Longa造模法[9]，即線栓法制備大鼠左側(cè)中動脈供血不足的腦缺血再灌注(MACO)模型。造模方法：術(shù)前禁食12 h，予水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠取仰臥位，固定四肢及頭部，備皮暴露頸部皮膚并消毒，沿頸中線開一約2 cm開口，鈍性分離大鼠左側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，將消毒好的線栓插入5 mL注射器針頭，線栓鈍圓頭漏于注射器針尖外部，沿頸外動脈靠近三者分叉處向頸總方向插入約5 mm，借助注射器針頭繼續(xù)將線栓插入頸總后拔出注射器針頭，將線栓輕輕緩慢退出至分叉處后插入頸內(nèi)動脈，插入深度約16～18 mm，用縫合線將線栓固定，縫皮，2 h后打開縫合線，拔線栓至有阻力時停止，剪去線栓，縫合黏膜及皮膚，消毒。期間均使大鼠位于干凈溫暖的籠盒中，待大鼠清醒后單獨飼養(yǎng)觀察。

1.4 干預(yù)治療 各干預(yù)組藥物根據(jù)大鼠體表面積劑量換算公式[10]計算給藥量為4.5 g/mL，給藥劑量為1 mL/100 g、2次/d。剩余各對照組(正常組、假手術(shù)組、模型組)均以生理鹽水灌胃，灌胃劑量同藥物劑量即1 mL/100 g、2次/d。

1.5 取材方法 各干預(yù)組及模型組取材時間依據(jù)各不同時間點進行，正常組及假手術(shù)組于灌胃7 d后取材。以水合氯醛腹腔麻醉法進行大鼠麻醉后斷頭處死，快速取出腦組織，并于冰上迅速剝離海馬保存于-80℃冰箱中。

1.6 指標(biāo)檢測方法

1.6.1 神經(jīng)功能評分 取材前進行大鼠神經(jīng)功能評分并記錄，評分采用Garcia JH評分[11]，通過評估各組大鼠自主運動情況、體態(tài)的對稱性、前肢伸展運動、網(wǎng)屏實驗、兩側(cè)身體觸覺反射及兩側(cè)胡須觸覺反射情況，評分統(tǒng)計，評分區(qū)間為0-18分。

1.6.2 Western Blot檢測蛋白表達水平 實驗按照WB檢測方法進行操作，用ImagaJ軟件分析灰度值，以目的蛋白/內(nèi)參即p-JNK/GADPH灰度值的比值表示蛋白表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0進行數(shù)據(jù)整理分析，各組數(shù)據(jù)先進行正態(tài)分布檢驗及方差齊性的檢驗，其中，符合正太分布及方差齊的，組間比較采用單因素方差分析，不符合的進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后分析；多組間比較則采用LSD法進行量量比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能Garcia JH評分 如表1所示，正常組與假手術(shù)組同期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與正常組及假手術(shù)組比較，模型組及各干預(yù)組評分均低于空白組及假手術(shù)組(P<0.05)。與灌胃1 d組比較，模型組及各干預(yù)組灌胃3 d、7 d組評分均明顯增加(P<0.05)。與灌胃3 d組比較，模型組及各干預(yù)組灌胃7 d時評分均明顯增加(P<0.05)。與模型組同期比較，各干預(yù)組評分均高于模型組(P<0.05)。與失荅剌知丸組同期比較各拆方組評分均低于失荅剌知丸組(P<0.05)。與拆方Ⅰ組同期比較，拆方Ⅱ、Ⅲ組評分均高于拆方Ⅰ組(P<0.05)。與拆方Ⅱ組同期比較，拆方Ⅲ組評分低于拆方Ⅱ組(P<0.05)。

2.2 Western Blot檢測結(jié)果 如圖1、圖2所示，各組方差齊性概率均>0.05，認為方差齊。其表達結(jié)果顯示如下：假手術(shù)組與正常組表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組及正常組同期比較，模型及各干預(yù)組蛋白表達均高于假手術(shù)組及正常組(P<0.05)。與灌胃1 d組比較，模型組及各干預(yù)組3、7d時p-JNK蛋白表達均有降低(P<0.05)。與灌胃3 d組比較，模型組及各干預(yù)組灌胃7d時p-JNK蛋白表達均有明顯降低(P<0.05)。與模型組同期比較，各干預(yù)組p-JNK蛋白表達均低于模型組(P<0.05)。與失荅剌知丸組同期比較，各拆方組蛋白表達均高于失荅剌知丸組(P<0.05)。與拆方Ⅰ組比較，拆方Ⅱ、Ⅲ組p-JNK蛋白表達均低于拆方Ⅰ組(P<0.05)。與拆方Ⅱ組比較，拆方Ⅲp-JNK蛋白表達高于拆方Ⅱ組(P<0.05)。

組別n1d3d7d正常組617.59±0.417.53±0.2117.46±0.25假手術(shù)組617.23±0.3517.29±0.3717.31±0.20模型組64.74±0.80﹡8.02±0.94﹡9.65±1.23﹡失荅剌知丸組68.44±1.17﹡#11.86±1.14﹡#△14.55±0.71﹡#△▽拆方Ⅰ組66.53±0.88﹡#◇9.03±1.21﹡#△◇11.68±1.15﹡#△▽◇拆方Ⅱ組67.33±1.03﹡#◇10.64±0.54﹡#△◇13.84±0.62﹡#△▽◇拆方Ⅲ組67.09±0.83﹡#◇10.06±0.87﹡#△◇12.74±1.34﹡#△▽◇

注：與正常組及假手術(shù)組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05;與灌胃1d比較，△P<0.05;與本組灌胃3d比較，▽P<0.05;與失荅剌知丸組比較，◇P<0.05。

3 討論

缺血性卒中的病理基礎(chǔ)以腦血流動力學(xué)的改變?yōu)橹鳎S著年齡的增長以及各種老年病和血管疾病的發(fā)生，顱內(nèi)外動脈變構(gòu)[12]，血栓形成和栓子脫落的風(fēng)險增加，從而導(dǎo)致了本病的發(fā)生。本病致殘率極高，以神經(jīng)功能缺損為主要表現(xiàn)[13]。本病治療的關(guān)鍵是腦缺血后腦血流的恢復(fù)，但再灌注往往可加重腦缺血組織的損傷[14]，神經(jīng)細胞缺血再灌注損傷導(dǎo)致JNK激活[15]，JNK通路對凋亡的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[16]。JNK蛋白激酶有3個基因10種亞型，抑制其活化可降低腦組織的損傷[17]。失荅剌知丸出自《回回藥方》殘卷十二“眾風(fēng)門”篇，原方載“能開纏腸肚風(fēng)病,最通經(jīng)絡(luò)”[18]，可知其以治療腦中風(fēng)經(jīng)絡(luò)不通所致口眼喎斜、半身不遂等癥。且前期課題組研究已知該方高劑量組用于治療缺血性中風(fēng)時效果優(yōu)于尼莫地平[5-7]，對其進一步的研究應(yīng)用更值得探索。觀察原方組成知其以化痰通絡(luò)、芳香利濕為主，但因其藥方中有多味不常用藥，且其中巴豆、蘆薈等用量較大，臨床應(yīng)用多有顧忌，故研究其組方特點進行本實驗。

本實驗研究結(jié)果表明，失荅剌知丸可明顯降低大鼠腦損傷癥狀，改善大鼠神經(jīng)功能，下調(diào)JNK蛋白表達，減低凋亡發(fā)生。其各拆方組中，以拆方Ⅱ組(即巴豆霜、柴胡、黑訶子、蘆薈)表達結(jié)果最具優(yōu)勢，考慮該組藥物可能為失荅剌知丸發(fā)揮治療作用的主要藥物組成，以君臣佐使配伍理論探討該方組成，考慮該四味藥物可能是該方的君藥或君臣藥。后期可對失荅剌知丸進一步探索，以探討其治療機制及組方原則。