不同提取方法對檢測單頭白背飛虱攜帶SRBSDV靈敏度的影響

崔麗賢， 李戰(zhàn)彪， 謝慧婷， 秦碧霞， 蔡健和

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/廣西作物病蟲害生物學(xué)重點實驗室， 廣西 南寧 530007)

南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)是由遷飛性害蟲白背飛虱〔Sogatellafurcifera(Horváth)〕進(jìn)行持久性傳播的一種病毒[1-3]。我國廣大稻區(qū)南方水稻黑條矮縮病毒病的初侵染源主要是春季帶毒遷入的白背飛虱，初侵染源在早稻或其他寄主植物上擴(kuò)繁后，再經(jīng)白背飛虱傳播至中稻或晚稻上[4]。廣西毗鄰白背飛虱境外蟲源地之一的越南，也是境外白背飛虱遷飛至我國東北部稻區(qū)的重要途經(jīng)地[5-6]。2017年廣西中晚稻南方水稻黑條矮縮病發(fā)生嚴(yán)重，全區(qū)絕收面積高達(dá)3 133 hm2，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，病害發(fā)生同時監(jiān)測到白背飛虱的蟲源比率較大[7]。因此，掌握白背飛虱種群帶毒情況，對SRBSDV的早期監(jiān)測及進(jìn)行科學(xué)防控具有重要意義。篩選出靈敏度高、操作簡便、經(jīng)濟(jì)、快速的檢測方法，對檢測境外蟲源的帶毒率和田間初期病苗的快速鑒定有重要的實際意義。對于研究白背飛虱體內(nèi)病毒的檢測，常用Trizol試劑進(jìn)行RNA提取，RT-PCR的方法進(jìn)行檢測[8]。白背飛虱個體較小，攜帶RNA量少，提取其總RNA較為困難。目前市場上針對昆蟲開發(fā)的RNA提取試劑很少，而且多數(shù)采用Trizol等氧化性較強(qiáng)的試劑，且價格昂貴，難以應(yīng)用到大規(guī)模的單頭蟲體檢測中。目前，尚未見關(guān)于比較白背飛虱體內(nèi)RNA提取方法的相關(guān)報道。因此，采用不同方法提取單頭蟲體的總RNA，并比較分析其RNA用于RT-PCR檢測SRBSDV的靈敏度，以期能找到較好的白背飛虱RNA提取方法用于大規(guī)模帶毒率檢測，為SRBSDV早期檢測及科學(xué)防控提供指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1供試材料

將健康水稻秧苗飼養(yǎng)的白背飛虱轉(zhuǎn)到感染SRBSDV的病株上飼養(yǎng)，待蟲體發(fā)育為成蟲，度過循回期，作為帶毒介體備用。將單頭白背飛虱成蟲轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，并置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2RT-PCR擴(kuò)增引物

從Genebank下載已報道的SRBSDV S10片段序列，通過Vector NTI進(jìn)行序列比對后進(jìn)行引物設(shè)計，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，目的片段長度為920 bp，引物序列如下：SRBSDV-S10-F,5′-CCACATCGCGTCATCTCAAACTAC-3′;SRBSDV-S10-R,5′-CGGTCTTACGCAACGATGAA

CC-3′。

1.3總RNA提取

1.3.1Trizol試劑盒法參照試劑盒試驗方法進(jìn)行。

1.3.2改良Trizol法將單頭白背飛虱置于1.5 mL離心管中，加入少量液氮并用燒鈍藍(lán)色槍頭小心研磨，之后加入50 μL Trizol提取液，繼續(xù)研磨至蟲體裂解完全；向EP管中再次加入600 μL Trizol提取液，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min；加入400 μL的酚/氯仿/異戊醇(體積比為25∶24∶1)，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min，4℃12 000 r/min離心10 min；取上清液至新的1.5 mL離心管中，加入200 μL的氯仿，劇烈震蕩15 s，4℃ 12 000 r/min離心10 min；取上清液至新離心管，加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒輕輕混勻，-20℃下放置15～20 min；4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入300 μL 75%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀，4℃ 6 000 r/min離心4 min，洗滌2次；室溫下靜置5 min晾干，加20 μL DEPC水溶解沉淀。RNA溶液置于-20℃冰箱(短期)或-80℃冰箱(長期)備用。

1.3.3改良CTAB-LiCl法CTAB提取液提前放入65℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱30 min；將單頭白背飛虱置于1.5 mL的離心管中，加入100 μL CTAB提取液(65℃預(yù)熱)并用燒鈍藍(lán)色槍頭研磨后，再加入500 μL CTAB提取液(65℃預(yù)熱)，震蕩混勻后置于65℃水浴10～15 min，期間顛倒混勻3～5次；取出離心管冷卻至室溫，加入500 μL的氯仿/異戊醇(體積比為24∶1)，劇烈震蕩15 s，4℃靜置 20 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清至新的1.5 mL離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置40 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min；棄上清液，加入300 μL 75%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀，4℃ 6 000 r/min離心4 min；沉淀晾干后加入120 μL DEPC水重新溶解沉淀，室溫靜置10 min，加入1/3體積8 mol/L的LiCl溶液，混勻，4℃放置過夜；4℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清；加入300 μL 75%乙醇(用DEPC水配制)洗滌沉淀，4℃ 6 000 r/min離心4 min；室溫下靜置5 min晾干，加20 μL DEPC水溶解沉淀，RNA溶液置于-20℃冰箱(短期)或-80℃冰箱(長期)備用。

1.3.4改良異硫氰酸胍法將單頭白背飛虱置于1.5 mL的離心管中，加入少量液氮并用燒鈍藍(lán)色槍頭小心研磨后，加入50 μL 異硫氰酸胍提取液，繼續(xù)研磨至蟲體裂解完全；再次加入600 μL異硫氰酸胍提取液，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min；加入3 mol/L的CH3COONa 40 μL，水飽和酚600 μL，氯仿/異戊醇(體積比為24∶1)120 μL，每加入一種試劑后均顛倒混勻，4℃靜置15 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻，-20℃下放置15～20 min；4℃12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入300 μL 75%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀，4℃ 6 000 r/min離心4 min，洗滌2次；室溫下靜置5 min晾干，加20 μL DEPC水溶解沉淀。RNA溶液置于-20℃冰箱(短期)或-80℃冰箱(長期)備用。

1.3.5NaOH 粗提法將單頭白背飛虱置于1.5 mL離心管中，加入20 μL 0.5 mol/L的NaOH溶液(DEPC水處理)并用燒鈍藍(lán)色槍頭小心研磨，盡量將蟲體搗碎，研磨時間約2 min，3 000 r/min離心3 min，取上清液用0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液稀釋20倍，置-20℃冰箱(短期)或-80℃冰箱(長期)備用。

1.4RNA電泳檢測

將1.3獲得的RNA各2.5 μL(除NaOH 粗提法所得的RNA外)于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析(120 V，30 min)，檢測RNA完整性。

1.5RT-PCR擴(kuò)增靈敏性檢測

將1.3獲得的RNA提取液0.5 μL及各提取液的10倍梯度稀釋液作模板進(jìn)行一步法RT-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物約920 bp。反應(yīng)體系(10 μL)：10×RT-PCR Buffer為1 μL，dNTP混合液0.4 μL，5×RT-PCR增強(qiáng)因子2 μL，RNA酶抑制劑0.1 μL，HotmasterTaq聚合酶0.5 μL，Quant RTase 0.1 μL，上下游引物各0.6 μL，RNA模板0.5～0.7 μL，補(bǔ)充ddH2O至10 μL。反應(yīng)程序：45℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，75℃延伸45 s，循環(huán)35次；75℃繼續(xù)延伸10 min；反應(yīng)產(chǎn)物各取2.5 μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)檢測后紫外燈下觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1不同提取方法總RNA的完整性

Trizol試劑盒法、改良Trizol法、改良CTAB-LiCl法和改良異硫氰酸胍法4種方法均可提取到較為完整的RNA，且所提取的RNA條帶明亮，邊緣整齊，除Trizol試劑盒法和改良異硫氰酸胍法在加樣孔附近有污染外，其余2種方法泳道均較干凈(圖1)。NaOH法提取RNA為粗提取，未進(jìn)行RNA電泳。

圖1不同方法提取的白背飛虱總RNA電泳圖譜

Fig.1 Electrophoretogram of total RNA extracted by different methods

2.2不同提取方法獲得的RNA純度及產(chǎn)量

由表1可見，前4種方法提取的RNA OD260/OD280在1.94～2.11，純度較好，NaOH法最差。由OD260/OD230可以看出，各提取方法所得RNA均脫鹽未完全，應(yīng)加75%乙醇多次洗滌沉淀。質(zhì)量濃度方面，改良Trizol法最高，為222.43 ng/μL；改良異硫氰酸胍與Trizol試劑盒法適中；改良CTAB-LiCl與NaOH法均較低。

表1不同提取方法獲得RNA質(zhì)量

2.3RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳

如圖2所示，5種方法均能擴(kuò)增出預(yù)期的條帶，除NaOH法擴(kuò)增較差外，其余幾種方法無明顯差異。

注：M，Mark DL2000；1，健康對照；2，陽性對照；3，Trizol試劑盒法；4，改良Trizol法；5，改良異硫氰酸胍法；6，改良CTAB-LiCl法；7，NaOH法。

Note: M, Mark DL2000; 1, healthy control; 2, positive control; 3, Trizol kit method; 4, improved Trizol method; 5, improved guanidinium thiocyanate method; 6, improved CTAB-LiCl method; 7, NaOH extraction method.

圖25種方法獲得RNA的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖譜

Fig.2 RT-PCR product electrophoresis of RNA by five methods

2.4不同提取方法檢測SRBSDV的靈敏度

由圖3可見，將不同提取方法獲得的RNA經(jīng)DEPC水梯度稀釋后(10-1～10-5)進(jìn)行RT-PCR靈敏性檢測，改良Trizol法RT-PCR擴(kuò)增的靈敏性最高，可以達(dá)到10-4，NaOH較差僅10-1，其余3種方法均為10-3。

圖3不同RNA提取方法檢測SRBSDV的靈敏性

Fig.3 SRBSDV sensitivity of different RNA extraction methods

2.5不同提取方法的耗時

NaOH法粗提耗時最短，5～10 min即可完成RNA粗提；改良CTAB-LiCl法耗時最長，需9.5 h才能完成，操作步驟較多，易造成RNA的降解。而改良異硫氰酸胍法、Trizol試劑盒法、改良Trizol法提取分別需2 h、1 h和1.5 h。

3結(jié)論與討論

由于白背飛虱蟲體較小，RNA含量相對更少，在提取過程中不易操作，特別是在研磨、加入裂解液及控制溫浴時間等操作上均需小心細(xì)致，避免RNA污染降解。試驗對比Trizol試劑盒法、改良Trizol法、改良CTAB-LiCl法、改良異硫氰酸胍法和NaOH粗提法5種不同方法對單頭白背飛虱RNA的提取效果及對檢測靈敏度的影響。結(jié)果表明，5種方法均可提取到RNA，除NaOH法外其余4種方法提取的RNA條帶均明亮整齊；改良CTAB-LiCl法在破碎蟲體時效果不佳，提取的RNA得率較少；改良Trizol法能夠提取出較完整蟲體RNA，RT-PCR進(jìn)行病毒檢測過程中產(chǎn)物量大，擴(kuò)增效果穩(wěn)定，NaOH法僅粗提取蟲體的總RNA，用于RT-PCR檢測SRBSDV中較其余幾種方法靈敏度茶差，但由于其操作簡便，費時較短，適用于大量樣品的檢測。對于昆蟲體內(nèi)RNA的提取最常用的是Trizol法，該方法提取的RNA質(zhì)量好，可用于后續(xù)RT-qPCR等的相關(guān)研究[9]，試驗還說明，Trizol法能夠提取高質(zhì)量的RNA，但該方法不適用于檢測大量材料。NaOH粗提法在植物組織DNA提取中有大量應(yīng)用，較少應(yīng)用于昆蟲RNA的提取，對檢測材料數(shù)量較多時，具有耗時少，經(jīng)濟(jì)實惠的特點，適用于檢測白背飛虱攜帶SRBSDV情況，其檢測靈敏性有待進(jìn)一步研究提高。