紫花苜蓿細胞質雄性不育系相關microRNA的鑒定

郭 強，王英哲，陳晶晶，周 仂，徐 博*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118； 2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學院，吉林 長春 130033)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種多年生豆科苜蓿屬植物。1958年，加拿大學者發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿的雄性不育現(xiàn)象，細胞質雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)指開花植物不能產(chǎn)生功能性花藥、花粉或雄配子的一種遺傳學現(xiàn)象[1]，這種現(xiàn)象主要由細胞質因子和細胞器基因控制[2]，其不育特性表現(xiàn)為雄器官的退化、畸形或功能缺失，導致花藥、花粉母細胞和雄配子的生長發(fā)育產(chǎn)生異常[3-4]。常用于作物的雜交育種。

隨著雄性不育系的發(fā)現(xiàn)，國外的眾多學者開始采用分子技術、組織培養(yǎng)法研究遺傳機理，并利用不育系培育雜交組合和轉基因材料[5-7]；1978年，吳永敷等[8]在我國內蒙地區(qū)從‘草原1號’中發(fā)現(xiàn)了6株紫花苜蓿雄性不育系；2008年，于洪柱等[9]發(fā)現(xiàn)了紫花苜蓿細胞質雄性不育材料—MS-GN。隨著紫花苜蓿細胞質雄性不育系及保持系的發(fā)現(xiàn)，對其機理的探索也在不斷深入。同時，國內學者[10-14]對不育系展開了同工酶分析、細胞學觀察、生殖生物學、生理生化機制等內容的研究；利用紫花苜蓿細胞質雄性不育系選育雜交組合并對其F1代進行生物學性狀及抗逆性研究[15-18]；有學者[19-21]利用SSR標記以及BSR技術對紫花苜蓿細胞質雄性不育恢復基因進行了定位分析，并且對紫花苜蓿細胞質雄性不育系及其保持系的花藥發(fā)育過程進行切片觀察，測定其在不同發(fā)育階段生理生化指標的變化。

植物microRNA是一類長度為20～26 nt的內源性非編碼小RNA[22]。成熟的microRNA長度為20～24 nt，多為21 nt[23]，其中長度為21～24 nt的microRNA占主體地位。植物microRNA參與植物體內許多重要的生命過程，擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)體內的miR160可通過負調控生長素響應因子進一步調控根冠細胞的發(fā)育[24]；Zea-miR390則可以調控玉米(ZeamayL.)莖尖細胞的發(fā)育及葉片的形態(tài)建成[25]；miR172，miR159，miR156/157則可以調控開花時期[26-27]。microRNA也參與調控植物的環(huán)境適應性，如miR398與植物的耐逆性密切相關[28]。另外，microRNA參與植物激素合成代謝與信號傳導，如miR160，miR164，miR167，miR528等microRNA均與生長素的信號傳遞有關，其中miR167還可以參與脫落酸等其他的信號通路的傳導[29-30]。

基于全基因組信息可知，在許多雄性不育植物的花粉發(fā)育過程中均有大量的microRNA參與[31-33]。在擬南芥中，miR165/166參與小孢子的發(fā)育，miR156和miR159負責調控植物絨氈層細胞的發(fā)育過程，miR159的靶基因屬于GAMYB(Gibberellins acid v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族，主要調控植物花藥細胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)過程中的赤霉素的傳導，miR159的異常表達會使絨氈層無法降解，最終使小孢子不能正常發(fā)育而喪失育性[34-36]。擬南芥中若缺乏miR165/166會使花藥只產(chǎn)生兩個花粉囊，最終會導致擬南芥的育性降低[37]；水稻(OryzasativaL.)中的OsmiR528，OsmiR159，OsmiR172d；玉米中Zea-miR397；油菜(BrassicanapusL.)中的bra-miR167，bra-miR172等miRNA都可能與植物的小孢子發(fā)育有關[31,38]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA可通過參與植物激素合成和應答過程來調控花粉的發(fā)育，例如miR167缺失會引起茉莉酸的合成異常，從而導致花藥不開裂以及散粉受阻；miR167的過表達同樣會引起植物不育現(xiàn)象的產(chǎn)生[30,39-41]。

植物microRNA是揭示植物雄性不育機制的有效方式之一，基于之前的研究發(fā)現(xiàn)：紫花苜蓿細胞質雄性不育的敗育可能與線粒體基因表達異常、淀粉蔗糖含量虧缺、絨氈層發(fā)育異常等現(xiàn)象有關[17,42]，因此，為深入探索不育機制，本試驗利用small RNA-seq技術，找到雄性不育相關的miRNA，為更好地利用紫花苜蓿不育系進行雜交育種工作提供理論基礎，以期選育出更具優(yōu)良性狀的種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所選用的材料為紫花苜蓿細胞質雄性不育系MSGN1A及其對應的同型保持系MSGN1B，MSGN1A和MSGN1B是以具有雄性不育性的‘公農(nóng)3號’為供體母本株系，通過保持系篩選，回交4代后選育出來的。所有植物材料均由吉林省農(nóng)業(yè)科學院提供。MSGN1A和MSGN1B的個體植株于2016年4月在吉林省長春市吉林農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學試驗田種植。選取現(xiàn)蕾期24 h的花藥部分，用于提取總RNA，備用。試驗設置3個生物學重復。

1.2 試驗方法

1.2.1總RNA的提取及質量控制 參照Garg等[43]的方法提取MSGN1A和MSGN1B花藥總RNA，用紫外分光光度計分別在230，260和280 nm處測定吸光值(OD230，OD260和OD280)，OD260/OD280和OD260/OD230均須≥1.8。采用Agilent 2100生物分析儀檢測總RNA的完整性，總RNA完整性值在8.0～10.0的樣品可用于后續(xù)試驗。

1.2.2small RNA文庫構建 將提取到的總RNA送北京百邁克生物技術公司，完成small RNA文庫的構建及測序工作。提取兩個樣品總RNA，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳法根據(jù)片段的長度分離RNA并回收長度在18～30 nt之間的條帶，構建2個small RNA文庫。

1.2.3miRNA的鑒定與分析 對已知miRNA的鑒定，采用miRBase(v21)軟件將比對上參考基因組的reads序列與known miRNA數(shù)據(jù)庫中的成熟miRNA序列進行序列比對。若序列與known miRNA完全一致，則這個reads將被認為是鑒定到的known miRNA。

考慮到miRNA的生物學特征，對于沒有被鑒定到known miRNA的序列，使用miRDeep 2軟件對novel miRNA做預測。利用miRDeep 2軟件包，將reads比對到基因組上的位置信息，得到可能的前體序列，根據(jù)reads在前體序列上的分布信息及前體結構能量信息，使用貝葉斯模型經(jīng)打分最終實現(xiàn)novel miRNA的預測。

1.2.4差異表達miRNA篩選及其靶基因功能注釋 以|log2(FC)|≥1；FDR≤0.01作為標準篩選差異表達的microRNA。差異倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)表示兩樣品間表達量的比值。

依據(jù)known miRNA和novel miRNA與對應物種的基因序列信息，使用Target Finder軟件[40]對miRNA靶基因進行預測。

基因功能注釋由北京百邁客生物技術公司進行，差異表達miRNA靶基因的功能注釋所使用的數(shù)據(jù)庫為GO (Gene Ontology，http://www.geneontology.org/)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/)。

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

對測序得到的數(shù)據(jù)進行質量控制，每個樣品的Clean Data均大于14.91 M。細胞質雄性不育系MSGN1A及其同型保持系MSGN1B的Raw reads分別為27.83 M和28.28 M，Clean reads分別為20.24 M和14.91 M，Q30(質量值大于30)分別為98.87%和99.03%。

表1 測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計表

2.2 miRNA的鑒定

為了進一步鑒定已知的miRNA，將比對上參考基因組的reads序列與已知miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase(v21)中的成熟miRNA序列進行比對。序列與已知miRNA完全相同的reads被認為是鑒定到的已知miRNA。針對miRNA的生物特征，對于未鑒定到known miRNA的序列，利用miRDeep 2軟件進行novel miRNA的預測。通過鑒定，本試驗共檢測到1 478個miRNA，其中已知miRNA 1 351個，novel miRNA 127個(表2)。

表2 miRNA統(tǒng)計結果

試驗檢測到1 351個known miRNA，分屬于136個miRNA家族，部分結果如圖1所示。每個家族中所含miRNA的數(shù)量和表達水平不盡相同，其中包括屬于miR166家族的247個miRNA，miR167家族的159個miRNA，miR160的家族124個的miRNA，miR172家族的105個miRNA，mi156家族的98個miRNA，miR319家族的88個miRNA等。成熟miRNA長度主要集中在20 nt到24 nt的范圍內，其中植物的miRNA以21 nt或24 nt為主，試驗鑒定出的novel miRNA的長度主要為21 nt，其次是24 nt和22 nt。

圖1 部分已知miRNA在miRNA家族中所含數(shù)量

2.3 差異表達miRNA的篩選與鑒定

在差異表達miRNA檢測過程中，使用|log2(FC)|≥1；FDR≤0.01作為篩選標準。試驗共計篩選出差異表達miRNA 130個，包括90個上調表達的miRNA和40個下調表達的miRNA。試驗共鑒定到40個差異表達的已知miRNA，分屬于15個miRNA家族，與保持系MSGN1B相比，紫花苜蓿細胞質雄性不育系MSGN1A中有24個上調表達miRNA，有16個下調表達的差異miRNA。

表3 差異表達的已知miRNA

2.4 miRNA靶基因預測

根據(jù)known miRNA和novel miRNA與其對應物種的基因序列信息，使用Target Finder軟件進行靶基因的預測，1 351個known miRNA中，有1 347個miRNA預測到靶基因，靶基因數(shù)目為9 848個；127個novel miRNA中，有126個miRNA預測到8 252個靶基因。注釋到的靶基因數(shù)目為16 458個。

表4 miRNA靶基因數(shù)目預測統(tǒng)計

2.5 差異表達miRNA靶基因注釋

試驗共得到16 458個靶基因，其中10 637個靶基因獲得功能注釋信息，紫花苜蓿細胞質雄性不育系MSGN1A與其同型保持系MSGN1B間注釋的差異表達miRNA靶基因在各注釋庫中的數(shù)目統(tǒng)計見,表5，共有10 637個miRNA靶基因被各個注釋庫注釋到，其中COG注釋庫中有3 104個miRNA靶基因被注釋到，包括815個差異表達miRNA靶基因；GO注釋庫中有5 147個miRNA靶基因被注釋到，包括1 264個差異表達miRNA靶基因；KEGG注釋庫中有3 479個miRNA靶基因被注釋到，包括861個差異表達miRNA靶基因；KOG注釋庫中有5 620個miRNA靶基因被注釋到，包括1 286個差異表達miRNA靶基因；Pfam注釋庫中有8 309個miRNA靶基因被注釋到，包括1 871個差異表達miRNA靶基因；Swissprot注釋庫中有6 535個miRNA靶基因被注釋到，包括1 662個差異表達miRNA靶基因；eggNOG注釋庫中有9 133個miRNA靶基因被注釋到，包括2 261個差異表達miRNA靶基因；Nr注釋庫中有6 535個miRNA靶基因被注釋到，包括2 612個差異表達miRNA靶基因。

表5 miRNA靶基因注釋統(tǒng)計表

2.5.1GO注釋分類 對差異表達miRNA靶基因進行GO分類，共計1 264個miRNA靶基因得到注釋。按照GO的三個大類進行下一次級分類，共分成41個功能群，其中包括18個生物學過程，12個細胞成分，11個分子功能(圖2)。

圖2 差異表達miRNA靶基因GO注釋分類

在生物學過程中，“代謝過程”所占比例最大，其次是“細胞過程”、“信號生物過程”、“生物調控”、“刺激應答”、“定位”、“細胞成分組織或生物合成”等生物學過程，它們的占比均大于10%；“發(fā)育過程”、“多細胞生物過程”、“繁殖過程”、“信號”、“多生物過程”、“生長”、“繁殖”、“免疫系統(tǒng)過程”等生物學過程的占比均在1%～10%之間；“生物附著”、“生物相”、“節(jié)律過程”的占比在0.1%～1.0%之間。

在細胞組分類別中，“細胞部分”和“細胞”占比最大，緊接著是“細胞器”、“膜”、“細胞器部分”、“高分子配合物”，其占比均大于10%；“胞外區(qū)”和“細胞連接”的占比在1%～10%之間；“膜封閉腔”、“病毒”以及“病毒部分”的占比在0.1%～1.0%之間。

在分子功能類別中，“合成”和“催化活性”是最大的功能類別；其次是“轉運蛋白活性”、“核酸合成轉錄因子活性”、“電子傳遞體活性”、“結構分子活性”、“酶調節(jié)活性”以及“分子傳感器活性”，占比均在占比在1%～10%之間；最后是“抗氧化劑活性”、“受體活性”、“蛋白合成轉錄因子活性”和“鳥苷酸交換因子活性”，占比均不到1%。

圖3 差異表達miRNA靶基因KEGG通路注釋

2.5.2KEGG通路分析 對差異表達miRNA靶基因進行KEGG通路分析，差異表達miRNA靶基因所涉及的通路的類別主要包括：“細胞進程”、“環(huán)境信息過程”、“基因信息過程”、“代謝”、“生物系統(tǒng)”等五個大類，在此基礎上進一步分為82個類別，其中有24個靶基因注釋到“代謝”中的“氨基酸生物合成”通路中，占比為5.61%；18個靶基因注釋為“內吞作用”通路中，占比4.21%；16個靶基因注釋到“核糖體”通路中，占比為3.74%；“RNA轉運”和“碳代謝”通路中分別有15個靶基因被注釋到，占比均為3.50%；“內質網(wǎng)中的蛋白質過程”、“泛素介導的蛋白水解作用”、“植物激素信號傳導”通路中分別有14個靶基因被注釋到，占比均為3.27%；有13個靶基因被注釋到“剪接體”通路中，占比為3.04%；“氨基糖和核糖代謝”和“氧化磷酸化”通路中有12個靶基因被注釋到，占比均為2.8%；“淀粉蔗糖代謝”通路中有8個靶基因被注釋到，占比為1.87%。

2.6與花藥發(fā)育相關的miRNA

在差異表達的miRNA中，mtr-miR5256的靶基因的功能注釋為“glucan ando-1,3-beta-glucosidase 4”,該基因參與淀粉蔗糖代謝。miR159靶基因的功能注釋為“MYB transcription factor”，“MYB轉錄因子”是花分生組織識別基因的啟動子。miR172靶基因功能注釋為“AP2 Domain transcription factor”，AP2類似轉錄因子主要調控花器分化和花期。miR396靶基因功能注釋為“生長調控因子HSP70蛋白”，miR169靶基因功能注釋為“CBF HAP2 like protein”，其主要作用是調控花期，這些差異表達的miRNA均有可能導致花粉敗育。

3 討論

MiR159靶基因的功能注釋為“MYB transcription factor”，“MYB轉錄因子”是花分生組織識別基因的啟動子。MYB是谷物糊粉蛋白細胞中赤霉素(Gibberellic acid，GA)信號的組成部分，在花的發(fā)育過程中起著重要作用[44]。陶園[45]認為，擬南芥轉錄因子ICE1(Inducer of CBF Expression 1)通過調控GAMYB基因來調節(jié)赤霉素信號傳導，從而影響花粉育性并調控植物生長。miR159的過量表達會引起與花發(fā)育過程相關的轉錄因子MYB的表達異常，從而進一步影響到花粉絨氈層的正常代謝，包括絨氈層的形態(tài)和結構異常等[46]。在本研究中miR159b和miRNA159c均下調表達，miRNA159d上調表達，這些miRNA的表達異常讓我們有理由認為miR159家族與紫花苜蓿細胞質雄性不育有著密切聯(lián)系。

試驗所得結果中miR172，miR172a，miR172d相較于保持系來說，在不育系中均上調表達，miR172靶基因功能注釋為“AP2 Domain transcription factor”，AP2-like轉錄因子主要調控花器分化和花期。AP2-like轉錄因子對花器官的生成是至關重要的，如果花器官發(fā)育出現(xiàn)異常情況(如花絲和花粉囊發(fā)育異常)就很可能會使花粉粒無法正常發(fā)育，從而導致花粉敗育[47]。Chen等[48]研究認為，miR172過表達會導致植株的花期提前以及花器官發(fā)育畸形，其表型與ap2突變體表型類似，最終導致配子異常發(fā)育。因此，miR172在不育系中的表達量降低也可能導致花粉敗育，具體的調控模式還需進一步研究。

miR396靶基因功能注釋為“生長調控因子HSP70蛋白”。試驗結果顯示miR396家族的miR396，miR396a，miR396b-5p，miR396c-5p，miR396d，miR396e等miRNA在不育系中上調表達，而miR396在初級和成熟的miRNA中都具有高度保守性，是“擬南芥生長調節(jié)因子”家族成員[49-50]。Yang等[51]認為miRNA396介導的NtGRF-like基因表達調控通路與煙草葉片和花的發(fā)育過程密不可分，這些miRNA對應的靶基因調控花的發(fā)育過程，也就是說，miR396的異常表達可能影響花的發(fā)育。

由結果可知，與保持系相比，miR169c在不育系中上調表達，miR169靶基因功能注釋為“CBF HAP2 like protein”，其主要作用是調控花期，擬南芥miR169家族成員是發(fā)育過程和刺激通路中普遍存在的調控因子[52]。因此，miR169的表達量降低會可能導致花期的提前或延遲，影響花藥的發(fā)育等過程。

4 結論

差異表達microRNA靶基因功能注釋結果顯示，與紫花苜蓿細胞質雄性不育相關的差異表達microRNA家族主要有4個，包括miR159，miR172，miR396，miR169；其靶基因的功能主要是調控花藥的發(fā)育，其次是調控花期以及信號傳導；micro RNA靶基因主要涉及的通路有：“代謝過程”、“信號生物過程”、“植物激素信號傳導”、“氧化磷酸化”和“淀粉蔗糖代謝”等，而差異表達microRNA靶向的轉錄因子中多為控制花期、花藥發(fā)育和信號傳導等過程的因子，對不育系的敗育起到一定的影響。本試驗結果可初步揭示紫花苜蓿不育系的分子機理，為利用紫花苜蓿不育系進行雜交育種提供理論基礎，從而選育出具有優(yōu)良性狀的紫花苜蓿種質資源。