根際促生菌微膠囊劑研發及對苜蓿、燕麥促生效果評價

李 琦，姚 拓*, 阿不滿，楊曉玫,，張建貴,，馮 影

(1.甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室, 甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅草原技術推廣總站，甘肅 蘭州 730000)

根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指具有一定促生能力的細菌或藍細菌等[1]，具有與植物聯合固氮、溶解土壤難溶性磷素、產生植物生長激素和抑制病原菌等優良特性[2-3]。以PGPR菌株為基礎研制的微生物菌劑已成為國內外應用微生物研究的熱點之一，目前在我國農業農村部登記的微生物菌劑產品共有根瘤菌劑、固氮菌劑、溶磷菌劑、硅酸鹽菌劑、菌根菌劑、光合菌劑、有機物料腐熟劑、復合菌劑和生物修復菌劑9個品種[4-5]。微生物菌劑劑型主要有瓊脂、固體、顆粒、液體和凍干等5個品種，新劑型的應用主要為包衣劑和微膠囊劑[6]。固體和液體劑型在制備方法上較為方便，但存在許多不足：液體劑型產品保持期短(一般為2～3個月，而農業農村部標準為6個月以上[7])，雜菌污染率高，菌劑施入土壤后微生物存活率低[5]；固體劑型的最佳吸附載體材料草炭已為國家重點資源保護對象，作為載體的應用前景不佳，不利于大批量菌劑生產[4]。因此，新劑型的研發與應用十分重要。

微膠囊菌劑(Microcapsules)是指利用物理或化學手段將游離微生物限定在特定載體內，使其高濃度富集制得的一類微生物制劑[8]。目前微膠囊菌劑已廣泛應用于食品發酵、制藥和廢水處理等領域[9-17]，但對促生菌微膠囊劑的研究較少，微膠囊菌劑可以提高微生物活性，具有良好的緩釋性能，并能屏蔽外界不良環境因素，是理想的菌肥劑型之一。微膠囊菌劑的包埋材料主要為海藻酸鈉(Sodium alginate，SA)，海藻酸鈉是一種從褐藻類植物中提取的高分子多糖[18]，當海藻酸鈉的水溶液中存在二價陽離子時，海藻酸鈉中的鈉離子會與二價陽離子發生絡合反應，形成凝膠微球[19]。微膠囊制作的操作步驟為：將細胞懸濁液與海藻酸鈉溶液混合后，用造粒器具將其滴入一定濃度的氯化鈣溶液中，經一段時間的固化反應后制成包埋顆粒[9]。

本研究以前期分離篩選出的4株優良促生菌菌株為基礎，海藻酸鈉為包埋劑，氯化鈣為交聯劑，評價微膠囊操作性和成球形，并測定微膠囊菌劑活菌數、包埋率及增殖倍數，確定海藻酸鈉與氯化鈣的最佳濃度配比，測定微膠囊劑的耐鹽、耐堿性。對單一菌株和復合菌株進行包埋，通過盆栽試驗探究PGPR微膠囊劑對苜蓿(Medicagosativa)、燕麥(Avenasativa)的促生效果，以期為PGPR微膠囊劑的研發應用提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：PGPR菌株，由甘肅農業大學草業學院草地微生物多樣性實驗室提供(表1)。菌株由實驗室前期從不同植物根際分離篩選而出，具有較強的固氮、溶磷和分泌植物生長素等能力。

表1 供試菌株

供試植物：燕麥品種隴燕3號(Avenasativa‘Longyan No.3’)，發芽率≥90%；苜蓿品種隴威6010(Medicagosativa‘Longwei 6010’)，發芽率≥98%，由甘肅農業大學草業學院提供。

盆栽容器：市售塑料杯，高17.7 cm，上口直徑8.9 cm，下口直徑5.6 cm，杯底部扎有5～10個2 mm圓孔用于滲水。

包埋劑：海藻酸鈉(SA)，分子式：(C6H7NaO6)n，分析純(Analytical reagent，AR)，購自天津光復精細化工研究所，用前配置一定濃度的水溶液，海藻酸鈉遇高溫高壓易變性，因此將海藻酸鈉水溶液置于80℃恒溫水浴鍋中高溫滅菌60 min，室溫無菌保存備用。

交聯劑：氯化鈣(CaCl2)，分子式：CaCl2·2H2O，試劑AR，購自國藥集團化學試劑有限公司，用前配置一定濃度的水溶液，滅菌，室溫無菌保存備用。

破囊液(檸檬酸鹽緩沖液)：0.2 mol·L-1檸檬酸鈉(分子式：C6H5Na3O7)溶液，試劑AR，滅菌。

造粒器具：一次性無菌注射器，規格20 mL，針頭型號1.2×30，購自鎮江康利醫療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1微膠囊菌劑制備 于超凈工作臺中，按以下步驟操作：1)取斜面保存的菌株接種于LB液體培養基中，經搖床培養的菌液測定吸光度值(Optical density，OD)大于0.5后與包埋劑以1∶1的比例混合，分別使混合溶液中SA濃度為2%，3%，4%。2)配制濃度為2%，3%，4%的CaCl2溶液，將3種濃度的CaCl2溶液分別置于磁力攪拌器上，注射器分別吸取步驟1中制備好的3種濃度的混合溶液，針頭垂直對準CaCl2溶液液面中心位置，液面高度15～20 cm，緩慢推動注射器活塞，使混合溶液呈水滴狀滴入CaCl2溶液中，液滴滴落速度保持在25～30滴·min-1，經一段時間的固化交聯反應形成微膠囊，共制成9個濃度處理配比。3)將制備出的顆粒室溫下交聯24 h后濾出，無菌生理鹽水洗滌3～5次，4℃保存。將制備好的新鮮包埋顆粒于LB液體培養基中增殖培養48 h，制作增殖后的包埋顆粒，4℃保存。所制得包埋顆粒結合其操作性和成球性，選擇最佳濃度配比范圍[21]。

1.2.2微膠囊菌劑活菌數、包埋率及增殖倍數測定 稱取不同濃度配比下制作的新鮮包埋顆粒和增殖后的包埋顆粒各1 g，參照薛偉明[22]的方法，將0.2 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液9 mL加入含包埋顆粒的試管中，旋渦振蕩器震蕩5～10 min，使微膠囊充分溶解，菌體釋放到溶液中，以不接菌的微膠囊作為空白對照，平板菌落計數[7]，每個處理3次重復。各指標計算公式[23]如下：

包埋顆粒活菌數(cfu·g-1)=平板計數菌落數/顆粒重；

包埋率(%)=包埋顆粒中的活菌數/總活菌數×100%；

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增殖倍數=增殖后微膠囊活菌數/增殖前微膠囊活菌數。

1.2.3微膠囊菌劑耐鹽、耐堿性評價 以液體劑型為對照，與篩選出最佳配比的微膠囊菌劑作比較，測定2種劑型菌劑對不同濃度鹽、堿環境的耐受性。

耐鹽性測定：配制NaCl濃度0.1%，0.2%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的LB液體培養基，并做不接菌的空白對照，每個濃度配制9 mL，共計8個處理，每個處理3次重復，滅菌。將2種菌劑分取1 g接種于配制的培養基中，28℃下160 r·min-1培養48 h，測定2種劑型菌劑在光波長為600下的吸光度值，結果取平均值。OD值測定方法為液體劑型培養到48 h后，以不接菌的培養基調零，測定不同培養液的OD值，然后以NaCl濃度為橫坐標，OD值為縱坐標作圖。微膠囊劑型培養到48 h后，將培養液濾出，無菌濾紙吸干微膠囊表面水分，加入9 mL檸檬酸鹽緩沖液，旋渦振蕩器震蕩5～10 min充分溶解微膠囊，以不接菌的空白微膠囊的溶解液調零，測定不同溶解液OD值，所得值乘以稀釋倍數，作圖。

耐堿性測定：配制pH值4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的LB液體培養基，測定方法同上。

1.2.4微膠囊菌劑對苜蓿、燕麥促生效果評價 2018年9月在甘肅農業大學植物組織培養室進行盆栽試驗。選取顆粒飽滿且大小一致的苜蓿種子約300粒、燕麥種子約150粒分別置于150 mL三角瓶中，加入1%的NaClO溶液50 mL，不斷晃動三角瓶滅菌10 min，無菌水清洗3～5次，然后加入70%酒精50 mL，滅菌5 min，無菌水清洗3～5次，將滅菌后的種子栽于塑料杯中，每杯約裝150 g土壤，種子種植量為苜蓿每杯10株，燕麥每杯6株。以液體菌劑和固體菌劑為參比，制備方法參照文獻[24]，設置空白對照進行室內盆栽試驗，并做不接菌的空白微膠囊對照，以探究微膠囊載體材料海藻酸鈉對植物的影響。試驗共設5個處理，每個處理5個重復：空白對照(Control check，CK)；不接菌的微膠囊空白對照(CKO)；液體菌劑(JY)；固體菌劑(JF)；微膠囊菌劑(JN)。苜蓿菌劑選用菌株426制作單一菌株菌劑，燕麥選用菌株ZNYC1，92，Gnyt1制作復合菌株菌劑，菌劑施肥量液體菌劑每杯5 mL，固體菌劑每杯5 g，微膠囊菌劑每杯5 g。待植株生長60 d左右測定各項指標。

測定指標及方法：株高：每個塑料杯中隨機選取3株，直尺測量自然高度，結果取平均值[25]；根系形態：每個塑料杯中隨機選取3株，用根系掃描儀(LA 2400 Scanner，Expression 1000 XL)測定植物的總根長、根表面積、根平均直徑、根體積，結果取平均值[26]。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel 2010進行處理和圖表繪制，方差分析采用SPSS 19.0統計軟件。

2 結果與分析

2.1 不同濃度配比下微膠囊的操作性和成球性

操作性和成球性同時較好的有處理SA 3%-CaCl23%，SA 3%-CaCl24%和SA 4%-CaCl23%。從不同濃度配比下包埋顆粒的操作性和成球性可以看出：SA濃度較低時，包埋顆粒易出現拖尾現象，成球性較差。CaCl2濃度較低時，SA與CaCl2的交聯能力弱，包埋顆粒易發生粘連。當SA和CaCl2濃度同時過高時，交聯程度過強，包埋顆粒易破碎，導致菌體流失(表2)。

表2 SA-CaCl2不同濃度配比下微膠囊的操作性和成球性

2.2 微膠囊的活菌數、包埋率及增殖倍數

不同濃度處理的微膠囊包埋率均達到80%以上，增殖倍數最高的為SA 3%-CaCl24%處理，此處理下的微膠囊粒徑在3～5 mm左右(圖1)，包埋率達到91.70%，增殖48 h后的微膠囊活菌數為增殖前的9.19倍，顯著高于其他處理，活菌數達到1010以上，這是液體和固體劑型很難達到的(表3)。

表3 微膠囊的活菌數、包埋率及增殖倍數

注：同列不同行有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，有不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note:Different rows of the same column,same letters indicate no significant difference(P>0.05),small letters mean significant difference (P<0.05),the same as below

2.3 微膠囊菌劑耐鹽、耐堿性評價

2.3.1耐鹽性 菌液中菌體的濃度與菌液吸光度值(OD值)成正相關關系，OD值越高，菌液含菌量越高。隨著鹽濃度的升高，2種劑型菌劑OD值均呈現先增高后下降的趨勢，在每個鹽濃度處理下膠囊菌劑OD值均高于液體菌劑。鹽濃度大于1.0%后，隨著鹽濃度的升高，膠囊菌劑與液體菌劑菌液濃度差異逐漸增大(P<0.05)(圖2)。

2.3.2耐堿性 隨著溶液pH值的升高，2種劑型菌劑OD值均呈現先增高后下降的趨勢。當pH=7.0時，2種劑型菌劑菌液濃度均為最高，且無顯著差異(P>0.05)，隨著pH升高或降低，菌液濃度逐漸下降。與膠囊菌劑相比，液體菌劑菌液濃度下降幅度較高，與膠囊菌劑的差異性顯著(P<0.05)，且隨著pH的升高或降低，差異逐漸增大。當pH=4.0時，膠囊菌劑的OD值為液體菌劑的4倍以上；當pH=10.0時，膠囊菌劑的OD值為液體菌劑的2倍以上(圖3)。

圖1 微膠囊小球成球情況

圖2 不同劑型菌劑在不同NaCl處理下培養48 h的吸光度值

圖3 不同劑型菌劑在不同pH處理下培養48 h的吸光度值

2.4 PGPR微膠囊劑對苜蓿、燕麥株高的影響

苜蓿和燕麥處理CKO與處理CK的株高均無顯著差異(P>0.05)，不同菌劑劑型處理對苜蓿、燕麥株高均有影響，表現為微膠囊菌劑(JN)>固體菌劑(JF)>液體菌劑(JY)。與CK處理相比，苜蓿、燕麥微膠囊菌劑處理株高最高，顯著高于CK處理(P<0.05)，分別較CK處理增加31.79%，11.60%(圖4)。

2.5 PGPR微膠囊劑對苜蓿、燕麥根系形態的影響

2.5.1PGPR微膠囊劑對苜蓿根系形態的影響 處理CKO與處理CK的苜蓿根系形態無顯著差異(P>0.05)，不同菌劑劑型處理對苜蓿總根長、根表面積和根體積均有影響，表現為微膠囊菌劑(JN)>液體菌劑(JY)>固體菌劑(JF)，對苜蓿根平均直徑無顯著影響。與CK處理相比，微膠囊菌劑處理總根長、根表面積和根體積最高，與CK處理差異均達到顯著水平(P<0.05)，較CK處理分別增加35.25%，40.02%和30.43%，效果好于液體菌劑和固體菌劑(表4)。

圖4 不同劑型PGPR菌肥對苜蓿、燕麥株高的影響

處理Treatment總根長Rootlength/cm根表面積Rootsurfacearea/cm2根平均直徑Rootdiameter/mm根體積Rootvolume/cm3CK245.96±26.73b12.87±0.69b0.266±0.0150a0.115±0.0160abCKO233.09±16.16b13.41±0.78b0.240±0.0134a0.081±0.0135bJY290.90±31.40ab16.65±1.03a0.251±0.0109a0.090±0.0141bJF262.53±11.66ab16.00±0.66ab0.237±0.0105a0.064±0.0017bJN332.65±13.53a18.02±0.50a0.259±0.0078a0.150±0.0069a

2.5.2PGPR微膠囊劑對燕麥根系形態的影響 處理CKO與處理CK的燕麥根系形態無顯著差異(P>0.05)，不同菌劑劑型處理對燕麥總根長、根平均直徑和根體積均有影響，對根表面積無顯著影響。與CK處理相比，微膠囊菌劑處理總根長、根平均直徑和根體積最高，與CK處理差異均達到顯著水平(P<0.05)，較CK處理分別增加41.56%，25.01%和105.83%，效果顯著(表5)。

表5 不同劑型PGPR菌肥對燕麥根系形態的影響

3 討論

3.1 PGPR微膠囊劑的研發及其耐鹽、耐堿性研究

微膠囊化技術作為一種新興技術，在農業領域引起了普遍關注。目前國內對微膠囊化技術的研究仍處于實驗室階段，存在許多不足：對微膠囊技術的基礎研究不夠深入；對微膠囊性能的評定體系不夠完善；對廉價包埋材料的挖掘不夠充分。但PGPR微膠囊劑能提高微生物活性，具有良好的緩釋性能，并能屏蔽外界不良環境因素，具有廣闊的發展前景[23]。本研究以微膠囊操作性和成球性為評價，進行活菌數、包埋率及增殖倍數測定，確定了微膠囊菌劑的最佳配方，該濃度配比下微膠囊活菌數達到1.08×1010cfu·g-1，增殖前后微膠囊活菌數均高于國家標準《農用微生物菌劑(GB 20287-2006)》[27]對顆粒菌劑有效活菌數(cfu·g-1)≥1.00×108的要求，遠高于邵鍇等[28]制作的微膠囊菌劑的含菌量，具有一定參考價值。

有研究證實，施用微膠囊菌劑可以延長菌株在土壤中的存活時間，形成局部優勢，使菌劑效果可以在植株根際穩定發揮。本研究結果表明，微膠囊菌劑增強了菌體對鹽堿脅迫的耐受性，在不同鹽堿濃度下菌液濃度均高于液體劑型，原因可能是液體劑型中的微生物與外界直接接觸，導致菌體對鹽堿脅迫的反應強烈，隨著脅迫增加，菌體大量死亡，菌液濃度下降明顯，而微膠囊內部形成的微環境為菌株提供了有效的生存空間，起到一定的緩沖和削弱作用，增加菌體對鹽堿環境的適應性。韓梅[23]研究發現，當NaCl濃度為2.5%時，液體和草炭劑型活菌數均為0，顆粒菌劑活菌數不足10個·g-1，本研究結果與其結果不同，本研究中NaCl濃度為2.5%時微膠囊菌劑仍有較高的活菌數，原因可能是本試驗選用的菌株是由高鹽堿土壤中分離出的菌株，在高鹽濃度下具有一定生存能力。

3.2 PGPR微膠囊劑對苜蓿、燕麥生長及根系形態的影響

菌劑施入土壤后，菌株能否在復雜的土壤環境下生存并形成優勢種群是菌劑發揮促生效果的關鍵，隨著對微生物肥料認識的提升，傳統劑型已逐漸不能滿足人們對微生物肥料需求的提升，新劑型的研發迫在眉睫。胡小加等[29]研究發現，制作芽胞菌類固定化細胞顆粒，其包埋顆粒能在根際效應的影響下，在植物根系有效定殖。李超敏等[30]研究發現，包埋根瘤菌-光合菌劑復合微膠囊劑，接種效果明顯優于菌液；李曉旭等[31]研究發現，施用微膠囊菌劑提高了大豆的產量和品質，顯著好于單施液體菌劑和草炭菌劑；何艷慧[32]研究發現，接種菌株SRPG-396微膠囊劑，施加菌劑后棉花鮮重增加17.84%且干重增加33.66%，根干物質量增加13.79%；殷遠滔[33]研究發現，利用海藻酸鈉-聚乙烯醇-生物炭包埋PGPR菌株，施用后苗高、地徑、一級側根數、地上干重和地下干重較CK增加18.80%，9.90%，43.20%，59.00%和30.50%。本研究對不同劑型菌劑進行盆栽試驗比較，結果發現接種PGPR微膠囊劑后，微膠囊載體成分海藻酸鈣對苜蓿、燕麥的生長無顯著影響，對微生物無毒性，可見海藻酸鈉作為載體不參與菌劑對植物的促生作用，對植物微生物均無毒害作用，是理想的載體材料。本研究同時得出，施用PGPR微膠囊劑可以增加苜蓿和燕麥的株高、總根長、根表面積、根平均直徑和根體積，對苜蓿和燕麥的生長有一定促進作用，尤其是對苜蓿和燕麥的根系生長促生效果顯著，好于液體菌劑和固體菌劑，其主要原因可能是微生物處于內部微環境中，有利于其生長繁殖，微膠囊中的菌株會逐漸被釋放出來，從而持續地增加植物根部和根圍的活菌數量，形成優勢群體，增強與土著菌的競爭能力，并能屏蔽外界不良環境，增強菌株抗逆性，提高菌劑使用效果，增加土壤肥力，因此與液體菌劑和固體菌劑相比，微膠囊菌劑對燕麥和苜蓿根系的促生效果更為顯著。

本研究利用根系掃描儀測定了PGPR微膠囊劑對苜蓿、燕麥根系性狀的影響，具有一定參考價值。然而土壤是一個復雜的生態體系，影響劑型使用效果的因素復雜多樣，今后應加強在建立健全完整的微膠囊菌劑評價體系的研究，制定對微膠囊菌劑釋放率、抗逆性、傳質性和菌劑在土壤中的定殖狀況等的評價標準。

4 結論

本研究確定PGPR微膠囊劑最佳配方為SA 3%-CaCl24%，此配方制作的微膠囊菌劑機械強度較好，提高了菌株對鹽堿脅迫的耐受能力。施用PGPR微膠囊劑可明顯提高苜蓿和燕麥的株高，以及不同根直徑下的總根長，并改善根系形態，對苜蓿和燕麥根系生長的促生效果好于液體菌劑和固體菌劑。