柳枝稷TIFY基因家族的鑒定與分析

趙曉曉，謝坤良，張舒夢，張 超，奚亞軍，孫風麗

(西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院，陜西 楊凌 712100)

TIFY基因家族是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子超家族，因含有高度保守的TIF [F/Y]XG氨基酸序列而得名，依據(jù)結(jié)構特點及進化關系分為TIFY，PPD，ZIM/ZML(ZIM-like)，JAZ四個亞家族[1-2]。TIFY家族成員可調(diào)控多種生長發(fā)育過程及脅迫防御反應：牽牛花(Pharbitisnil)的PnFL-2蛋白[3]含有TIFY家族典型的TIFY與CCT域，可能在花誘導中發(fā)揮作用；過表達水稻(Oryzasativa)OsTIFY11b[4]使得莖稈積累了更多的碳水化合物，進而促進種子大小與粒重增加；香蕉(Musaacuminate)MaTIFY1b[5]參與果實的成熟；擬南芥(Arabidopsisthaliana)PPD2[6]與NINJA共同調(diào)節(jié)葉片整齊度；野大豆(Glycinesoja)GsTIFY[7]參與碳酸氫鹽脅迫反應；毛竹(Phyllostachysedulis)PeTIFY[8]在脫水及冷脅迫中起作用；木豆(Cajanuscajan) CcTIFY[9]調(diào)控植株在銅脅迫下的響應。TIFY基因家族全基因組分析自擬南芥[1]、水稻[10]、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[11]等模式作物以后，已分別在雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)[12]、玉米(Zeamays)[13]、小麥(Triticumaestivum)[14]等植物中相繼報道。

JAZ蛋白(JAZs)隸屬TIFY基因家族的JAZ亞家族，是茉莉酸(jasmonic acid，JA)信號通路的轉(zhuǎn)錄抑制因子[15]。JAZs不含DNA結(jié)合結(jié)構域，必須依賴蛋白間的互作行使功能[1]：JAZ蛋白N末端弱保守的NT結(jié)構域可與DELLA蛋白互作[16]，DELLAs主要作用是抑制赤霉素(gibberellin，GA)信號傳遞，兩者的互作使得JA與GA信號通路聯(lián)系起來，調(diào)控植物的生長-防御平衡；ZIM結(jié)構域保守的TIFY基序是JAZs形成同源或異源二聚物的基礎[17]，ZIM結(jié)構域與NINJA和TPL阻遏蛋白的互作抑制了JA信號通路中MYC轉(zhuǎn)錄因子的活性[18]，JA應答基因的表達被關閉；JAZ蛋白C末端的Jas結(jié)構域十分保守，可與EIN3、EIL1[19]等轉(zhuǎn)錄因子互作，使得JA信號通路與乙烯(ethylene，Eth)信號通路交聯(lián)，進而調(diào)控植株的發(fā)育及抗病性。研究報道JA介導的JAZs轉(zhuǎn)錄水平的變化與生長素(auxin，IAA)、Eth，GA及油菜素內(nèi)脂(brassinolide，BRs)等激素信號的調(diào)節(jié)相關，這些激素形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，在植物的生長發(fā)育、激素應答及脅迫響應等方面發(fā)揮作用[20]。

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)為禾本科黍?qū)俣嗄晟鶦4草本植物，因具有生物質(zhì)產(chǎn)量大、纖維素含量高、抗逆性強、可在邊際土地生長、水肥需求少、對環(huán)境友好等優(yōu)點，成為國際上公認的模式能源作物[21-22]，TIFY基因家族具有多種的生物學功能，但在柳枝稷中尚未開展相關研究。本研究鑒定了柳枝稷基因組中的TIFY家族成員，并對其染色體定位、進化關系、基因結(jié)構、保守基序組成、啟動子區(qū)順式作用元件及時空表達模式等生物信息進行了分析，且通過定量實驗驗證了部分成員的激素應答及脅迫響應特性，從而為揭示TIFY基因家族在柳枝稷中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 柳枝稷TIFY基因家族的鑒定

從JGI數(shù)據(jù)庫(http://jgi.doe.gov/)下載柳枝稷蛋白數(shù)據(jù)，同時在Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)提取TIFY(PF06200)的隱馬爾科夫模型矩陣文件，然后利用HMMER搜索含有TIFY保守結(jié)構域的柳枝稷蛋白序列并通過結(jié)構域可視化及序列多重比對等方法再次確認其結(jié)構域是否完整，最終得到柳枝稷TIFY基因家族成員。

1.2 柳枝稷TIFY基因家族的分析

TIFY系統(tǒng)進化分析：將擬南芥AtTIFY[1]、水稻OsTIFY[10]及篩選到的柳枝稷TIFY蛋白序列提交到MEGA5.0進行序列多重比對，然后采用NJ(Neighbor-Joining)法繪制種間進化樹，設定自舉值為1000；

柳枝稷TIFY染色體定位分析：從JGI數(shù)據(jù)庫(http://jgi.doe.gov/)下載的基因組數(shù)據(jù)中提取基因位置信息，結(jié)合柳枝稷染色體數(shù)目及長度等信息，利用MapDraw軟件繪制基因的染色體定位圖譜；

柳枝稷TIFY種內(nèi)進化分析：將柳枝稷TIFY蛋白序列經(jīng)MEGA5.0多重比對后采用NJ法繪制進化樹，自舉值1 000；

柳枝稷TIFY基因結(jié)構分析：將柳枝稷TIFY家族成員的CDS序列及Genomics序列提交至GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/indx.php)在線軟件，對每個成員的外顯子與內(nèi)含子分布情況進行分析；

柳枝稷TIFY保守基序分析：將柳枝稷TIFY蛋白序列提交至MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)，設定搜索motif的個數(shù)為6，其它選項為默認參數(shù)；

柳枝稷TIFY啟動子區(qū)順式作用元件分析：從JGI數(shù)據(jù)庫(http://jgi.doe.gov/)提取基因上游2000bp片段，提交至PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。

柳枝稷TIFY時空表達模式分析：從JGI數(shù)據(jù)庫(http://jgi.doe.gov/)獲得各基因在不同組織的表達量數(shù)據(jù)，使用HemI軟件制作組織特異性表達圖譜。

1.3 部分成員的表達特性分析

植物材料及處理：挑選籽粒飽滿、大小均勻的柳枝稷低地型品種“Alamo”種子，先后使用70%無水乙醇表面消毒1 min，10%次氯酸鈉溶液滅菌5 min，然后使用無菌水沖洗3～4次，置于4℃條件下過夜，次日將處理過的種子置于帶有濾紙的培養(yǎng)皿上，于27℃(16 h/8 h)光照培養(yǎng)箱中生長。待幼苗根長2 cm左右時，轉(zhuǎn)移至水培容器內(nèi)繼續(xù)在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2～3 d換一次培養(yǎng)液，水培3周后用于激素與脅迫處理。激素處理參照水稻幼苗處理方式[10]，脅迫處理參照二穗短柄草幼苗處理方式[11]。取材部位為葉片，經(jīng)液氮處理后于—80℃保存。

RNA提取及熒光定量PCR：利用RNAiso Plus提取上述材料總RNA，參照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書進行反轉(zhuǎn)錄，使用Primer Premier 6.0設計基因特異引物；按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)說明書配置熒光定量PCR體系10 μl；使用QuantStudioTM3 Flex Real-Time PCR System進行PCR反應，兩步法；利用SigmaPlot12.5軟件處理數(shù)據(jù)、制作圖表，相對表達量以2-△△CT法計算。引物序列如表1所示。

表1 熒光定量PCR引物列表

注：PviTIFY10aF與PviTIFY10aR同時擴增PviTIFY10e，PviTIFY10f與PviTIFY10a基因；PviTIFY10bF與PviTIFY10bR同時擴增PviTIFY10g，PviTIFY10h與PviTIFY10b基因；EF-1-alpha為柳枝稷實時熒光定量PCR的內(nèi)參基因[23]

Note:PviTIFY10aFandPviTIFY10aRsimultaneously amplifiedPviTIFY10e,PviTIFY10fandPviTIFY10agenes;PviTIFY10bFandPviTIFY10bRsimultaneously amplifiedPviTIFY10g,PviTIFY10handPviTIFY10bgenes;EF-1-alphawas the internal reference gene of qPCR in switchgrass[23]

2 結(jié)果與分析

2.1 柳枝稷TIFY基因家族的鑒定

在柳枝稷基因組中共鑒定到48個TIFY序列，命名為PviTIFY(區(qū)別于菜豆(PhaseolusvulgarisL.)的TIFY序列PvTIFY[24])，命名順序參照OsTIFY，分屬ZML(7個)、TIFY(1個)、JAZ(40個)3個亞家族。其基本信息如表2所示，PviTIFY的CDS全長465～1 323 bp不等，編碼蛋白的氨基酸數(shù)目154～440個不等，TIFY保守基序呈現(xiàn)多種形式。

2.2 TIFY基因家族的進化分析

將柳枝稷PviTIFY序列、水稻OsTIFY序列及擬南芥AtTIFY序列共計86個蛋白序列進行多重比對后利用MEGA5.0構建進化樹，如圖1所示，TIFY基因家族的4個亞家族成員構成及分布如下，PPD亞家族僅包含雙子葉植物擬南芥的AtTIFY4a與AtTIFY4b；TIFY亞家族包含OsTIFY8、PviTIFY8a與AtTIFY8，但AtTIFY8與其他蛋白序列親緣關系較遠而同PviTIFY8b位于單獨分枝；ZML亞家族由3個物種的TIFY1與TIFY2構成，共計14個成員；剩余其它蛋白序列分屬JAZ亞家族，可分為以下3個類群，JAZⅠ，JAZⅡ，JAZⅢ，其中JAZⅠ僅包含PviTIFY與OsTIFY序列，共計19個；JAZⅡ含有最多的PviTIFY序列，占比為13/22；JAZⅢ包含的TIFY序列數(shù)目最多，計25個。

2.3 PviTIFY的染色體定位

依據(jù)基因組數(shù)據(jù)信息，對48個PviTIFY基因進行染色體定位，如圖2所示，除PviTIFY5b與PviTIFY11s位于沒有拼接到染色體的scaffolds上，其余46個PviTIFY分別定位于染色體1，2，4，5，6，7，8，9。在染色體9分布的PviTIFY數(shù)目最多，計24個，包含了PviTIFY11中除PviTIFY11s以外的所有成員，且形成了4個基因簇，9K與9N各兩個；其次為染色體2與染色體7，分別含有9個PviTIFY與6個PviTIFY；染色體4與染色體6均含有2個PviTIFY；染色體1N、染色體5K及染色體8K則各含有1個PviTIFY，分別是PviTIFY9c，PviTIFY8b與PviTIFY8a。

表2 柳枝稷TIFY基因家族基本信息

圖1 擬南芥、水稻、柳枝稷中TIFY的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 PviTIFY的結(jié)構特點

按照PviTIFY的進化樹順序，分析了各成員的基因結(jié)構與保守基序組成，如圖3所示：

PviTIFY10與PviTIFY11位于鄰近的兩個進化枝，含有相同的motif組成，即N-terminal，TIFY，Jas，歸屬JAZ亞家族。在8個PviTIFY10成員中，除PviTIFY10c外，其他PviTIFY10均由5個外顯子與4個內(nèi)含子組成，與PviTIFY10位于同一進化枝的PviTIFY11c，PviTIFY11d，PviTIFY11g，PviTIFY11j，PviTIFY11k，基因結(jié)構由3個外顯子與2個內(nèi)含子構成，而位于其鄰近進化枝的剩余PviTIFY11成員均不含內(nèi)含子。結(jié)合進化關系與結(jié)構特點將以上成員分屬JAZⅠ組與JAZⅡ組。

PviTIFY3，PviTIFY5，PviTIFY6，PviTIFY9及PviTIFY8b雖位于不同進化枝，但保守基序均由TIFY motif與Jas motif組成，同屬JAZ亞家族。其中PviTIFY6的外顯子與內(nèi)含子數(shù)目最多，含有7個外顯子與6個內(nèi)含子(PviTIFY6c含有6個外顯子與5個內(nèi)含子)，其次為PviTIFY9與PviTIFY3a，由5個外顯子與4個內(nèi)含子組成，而PviTIFY3b與PviTIFY3c則由4個外顯子與3個內(nèi)含子構成，PviTIFY8b與PviTIFY5的外顯子與內(nèi)含子數(shù)目相對較少，且PviTIFY5a無3，UTR。以上成員劃歸JAZⅢ組。

PviTIFY8a僅含有TIFY motif，為TIFY亞家族成員，基因結(jié)構由3個外顯子與3個內(nèi)含子組成，歸于TIFY組。

PviTIFY1與PviTIFY2含有其他亞家族成員沒有的GATA Zn-finger結(jié)構域，為ZML亞家族成員。在PviTIFY1成員中，PviTIFY1b的內(nèi)含子與外顯子數(shù)目最多，由9個外顯子與8個內(nèi)含子構成，且其長度在48個PviTIFY中最長，其他成員則由8個外顯子與7個內(nèi)含子組成，PviTIFY2均含有7個外顯子與6個內(nèi)含子，且PviTIFY2b無5’UTR。以上成員歸為ZML組

TIFY各成員在柳枝稷內(nèi)的分組結(jié)果同其在物種間的劃分結(jié)果(圖1)一致，且每組內(nèi)進化關系較近的成員間具有近乎相同的內(nèi)含子/外顯子組成及蛋白保守基序分布。

圖2 PviTIFY在染色體的分布

圖3 PviTIFY的進化樹、基因結(jié)構及保守基序

2.5 PviTIFY啟動子區(qū)順式作用元件分析

柳枝稷TIFY基因啟動子區(qū)順式作用元件統(tǒng)計結(jié)果如表3所示，除PviTIFY11m與PviTIFY11s外，其他46個柳枝稷TIFY成員的啟動子區(qū)都存在4～10種調(diào)控元件，其中大部分成員(60%以上)含有光響應、厭氧與缺氧脅迫及JA，ABA信號調(diào)控元件，半數(shù)成員包含干旱脅迫及GA，IAA信號調(diào)控元件，少部分成員含有低溫脅迫及SA信號調(diào)控元件，另有極少部分成員包含生物鐘、細胞周期及創(chuàng)傷應激調(diào)控元件。綜上所述，柳枝稷TIFY基因啟動區(qū)存在多種脅迫響應元件及激素信號調(diào)控元件，可能在柳枝稷抗逆反應及激素信號網(wǎng)絡中發(fā)揮作用。

表3 PviTIFY啟動子區(qū)順式作用元件分析

2.6 PviTIFY時空表達模式分析

柳枝稷TIFY成員在各種組織及發(fā)育階段的表達特性如圖4所示，PviTIFY中表達量較高的是10b，10g，10h，10a，10e，10f與11j，11k，11c，11b，11h及6b，6d，這些成員均為JAZ亞家族成員(圖3)。PviTIFY10的6個成員在剛出現(xiàn)的花序、授粉后25 d的小花與V3期的根中表達量最高，尤其是PviTIFY10b，它在各種組織與發(fā)育階段的表達量均是最高的；PviTIFY11的5個成員在授粉后25 d與30 d的小花中表達量較高，且PviTIFY11b與PviTIFY11h在V1與V3期的根、整個地上部、E4期的維管束及剛出現(xiàn)的花序中也有較高表達；PviTIFY6的兩個成員中PviTIFY6b在剛出現(xiàn)的花序、E4期的的莖與葉中表達量較高，在根與地上部也有表達。綜上所述，這些表達量較高的PviTIFY10與PviTIFY11可能在花序與根的發(fā)育中發(fā)揮作用，還可能影響產(chǎn)量的形成，而PviTIFY6則可能在植株形態(tài)建成中發(fā)揮功能。

圖4 PviTIFY時空表達模式

2.7 PviTIFY10各成員的表達特性

為驗證柳枝稷TIFY成員的激素應答及脅迫響應特性，我們選取了表達量較高的PviTIFY10計8個基因進行定量實驗。

各成員在不同激素處理下的表達特性如圖5所示：PviTIFY10a，PviTIFY10e與PviTIFY10f在JA處理下表達量升高，在其他激素處理下表達量變化不大；PviTIFY10b，PviTIFY10g與PviTIFY10h在JA與IAA處理條件下表達量是升高的，而在其他激素處理條件下呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)表達；PviTIFY10c在JA處理下表達量升高最明顯，同時也受到其他激素不同程度的誘導作用；PviTIFY10d在JA處理條件下先下調(diào)表達后逐漸上調(diào)表達，對其他激素處理響應模式規(guī)律性較差。對每種激素來說，JA可誘導PviTIFY10各成員的表達，IAA對PviTIFY10各成員均無抑制作用；SA，Eth，GA，ABA均可誘導PviTIFY10c，但對PviTIFY10b，PviTIFY10g與PviTIFY10h的表達是抑制的。

各基因的脅迫響應模式如圖6所示，PviTIFY10各成員在三種脅迫下的表達模式相同，即鹽處理下各基因的表達量迅速升高，其中PviTIFY10d在鹽脅迫下表達量升高最明顯；干旱處理下各基因同樣上調(diào)表達，且PviTIFY10c表達量最高；在冷脅迫中各基因表達量變化不明顯，除PviTIFY10c外，其他成員呈現(xiàn)較低的敏感性。

圖5 PviTIFY10各成員在不同激素處理下的表達模式

綜上所述，PviTIFY10各成員在JA處理及鹽與干旱脅迫下反應強烈，推測其可能在柳枝稷JA信號通路及鹽與干旱脅迫防御反應中發(fā)揮功能。

3 討論與結(jié)論

柳枝稷為異源四倍體，相對擬南芥、水稻、二穗短柄草等二倍體物種來說，所包含的TIFY基因家族成員數(shù)目較多，本研究共鑒定到48個PviTIFY，包含7個ZML、1個TIFY、40個JAZ，各成員TIFY motif的氨基酸序列除TIFYXG形式外包含多種類型，如TLSFXG，TLLFXG，TIVYXG等形式，與前人的報道一致[2]。TIFY蛋白在擬南芥、水稻、柳枝稷3個物種間分為6個類群：PPD，TIFY，ZML，JAZⅠ，JAZⅡ，JAZⅢ，從進化距離上看，PviTIFY同OsTIFY的親緣關系較近。除PviTIFY5b與PviTIFY11s外，其它46個PviTIFY分布在染色體3以外的染色體上，其中半數(shù)成員集中分布在染色體9，并且PviTIFY11各成員在染色體9成簇排列，這些信息可為成員間的進化提供依據(jù)。

柳枝稷TIFY蛋白按照進化關系及結(jié)構特點可分為5組：JAZⅠ，JAZⅡ，JAZⅢ，TIFY，ZML，每組內(nèi)進化關系較近的成員間具有近乎相同的內(nèi)含子/外顯子組成及蛋白保守基序分布，同水稻[10]與二穗短柄草[11]的TIFY基因家族成員結(jié)構組成規(guī)律相同。另一方面，不同分組的成員間基因及蛋白結(jié)構的組成差異為TIFY基因家族的進化提供了重要依據(jù)[25]。對于PviTIFY的基因結(jié)構，PviTIFY11成員中除與PviTIFY10位于同一進化枝的5個成員，剩余的14個成員都不含內(nèi)含子，如PviTIFY11a與PviTIFY11b，同它們在水稻與二穗短柄草中的同源基因一樣，可能在進化開始時就沒有內(nèi)含子，或者在進化中內(nèi)含子丟失了[10-11]；對于PviTIFY的保守基序，JAZ亞家族中僅PviTIFY10與PviTIFY11的N端含有NT motif，同水稻中的OsTIFY10與OsTIFY11[10,26]一樣。此外，其成員PviTIFY10c與PviTIFY11s缺少了Jas domain。這些具有特殊結(jié)構的成員可能在柳枝稷的進化中具有獨特性。柳枝稷中ZML亞家族成員的CCT domain分為了兩部分，其N端與JAZ亞家族成員的Jas/CCT-2 motif相似性很高而無法區(qū)分，GATA domain也由兩部分組成，其C端與JAZ亞家族成員N端的NT基序同樣具有一定程度相似性，另外，在柳枝稷PviTIFY6，PviTIFY10，PviTIFY11保守基序中還存在motif5，其功能有待研究。

圖6 PviTIFY10各成員在不同脅迫處理下的表達模式

JAZ亞家族的JAZ蛋白不僅是JA信號的關鍵因子，還是激素網(wǎng)絡的調(diào)控樞紐：水稻OsJAZ9與OsSLR1的互作介導了JA與GA的拮抗作用，進而協(xié)調(diào)植株的脅迫響應與生長發(fā)育[27]；棉花(Gossypiumhirsutum) GhJAZ3與GhSLR1的互作實現(xiàn)了JA與GA對表皮細胞分化及伸長的調(diào)控[28]；黃絲瓜蘚(Pohlianutans)PnJAZ1介導JA與ABA在鹽脅迫下的信號交談[29]。鑒于PviTIFY啟動子區(qū)存在多種脅迫響應與激素應答元件(表3)，本研究選定了表達量較高的JAZ亞家族的PviTIFY10成員進行定量實驗來驗證其在激素與脅迫處理下的表達特性，結(jié)果表明PviTIFY10對多種激素及脅迫有強烈反應(圖5,6)，推測其可能在柳枝稷脅迫防御反應與激素信號調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮作用。

柳枝稷JAZ亞家族成員具有明顯的時空表達特性，尤以PviTIFYI0各成員在花序、小花及根中的表達量最為顯著(圖4)。Hakata等[26]發(fā)現(xiàn)水稻TIFY基因過表達株系可通過JA信號途徑促進植株生長，表現(xiàn)出小花數(shù)目增加，開花天數(shù)減少、小花育性降低等農(nóng)藝性狀，其中OsTIFY10b過表達株系小花育性降低最少，因而產(chǎn)量較高。在本研究中OsTIFY10b的同源基因PviTIFY10b，同樣受到JA的誘導作用(圖5)，且在剛出現(xiàn)的花序及授粉后的小花中呈現(xiàn)較高表達(圖4)，結(jié)合基因的表達特性及同源基因在功能上的保守性推測PviTIFY10b很可能參與柳枝稷花序發(fā)育過程進而影響產(chǎn)量的形成。不僅如此，PviTIFY10b即Pavir.2NG586800(表2)為柳枝稷花逆轉(zhuǎn)相關候選基因[30]，本課題組曾對柳枝稷幼穗分化即花序發(fā)育這一生物學過程進行了顯微觀察[31]，且在利用柳枝稷幼穗進行人工穗芽誘導時發(fā)現(xiàn)了柳枝稷花逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象[32-33]，并經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序篩選到與柳枝稷花逆轉(zhuǎn)有關的候選基因[30]，以上研究可為柳枝稷花序發(fā)育分子調(diào)控機制解析及分子育種奠定基礎。

本研究利用TIFY結(jié)構域(PF06200)從柳枝稷基因組中搜索鑒定了48個TIFY家族成員，并且依據(jù)其系統(tǒng)進化關系和前人研究結(jié)果對家族成員進行了分類。通過對其染色體定位、基因結(jié)構、保守基序組成等生物信息學進行分析，進一步確定了柳枝稷TIFY基因家族的分類和進化關系。同時，通過分析TIFY基因家族的啟動子順式作用元件、時空表達模式以及PviTIFY10成員激素應答和脅迫響應的表達特性，初步證明了TITY家族參與激素調(diào)控、脅迫應答和花序發(fā)育等生長發(fā)育過程，為進一步研究柳枝稷TIFY基因家族成員的功能提供了一定的方向和基礎。