黃河三角洲鹽堿地花生根層土壤菌群結構多樣性

戴良香,康 濤,慈敦偉,丁 紅,徐 揚,張智猛,張 岱,李文金,*

1 山東省花生研究所, 青島 266100 2 泰安市農業科學院, 泰安 271000 3 河北農業大學植物保護學院, 保定 071001

黃河三角洲位于我國山東省,東經118°07—119°18,北緯36°55—38°12,是黃河在利津縣以下以及向下沖積而成的扇形三角洲。黃河三角洲不僅有大量的物種資源,而且土地、礦產、溫光等自然資源也很豐富[1- 2]。但生態環境相對脆弱,鹽漬化土地面積高達18萬hm2,嚴重影響了該區域經濟的可持續發展以及農業開發前景[3],探討治理機理和開發途徑對鹽漬化土地的開發利用具有指導性意義。

土壤鹽堿化是世界性難題,由于土壤有機質含量、酸堿度、水分及土壤母質的不同,與此環境相適應的土壤微生物種類各異。以往對鹽堿地土壤微生物的研究主要集中在耐鹽堿微生物的分離、鹽堿極端微生物的生態特征、不同植物群落土壤微生物的時空動態和區系特征[4- 5]、濕地土壤不同深度層次微生物特征[6- 7]、微生物量與土壤酶[8]、不同植物群落土壤養分與微生物活性以及不同改良措施及植被對鹽堿地土壤微生物的影響效果等方面[9-11],關于黃河三角洲地區土壤微生物多樣性研究多集中在米草[12]、檉柳[13]、白蠟、刺槐、臭椿林地[14]、堿篷、茵陳蒿、白茅、蘆葦[15]等耐鹽堿或鹽生草本、灌木和喬木類植物,有關鹽堿土壤種植糧油經類作物尤其是花生根層土壤微生物數量、種群結構、優勢菌群以及鹽脅迫與土壤微生物活動之間的生態關系的研究鮮見報道,為此,本試驗以黃河三角洲濱海鹽堿土為對象,利用焦磷酸高通量測序技術直接從土壤中提取總DNA,構建細菌16S rRNA基因克隆文庫,對黃河三角洲鹽堿地花生旺盛生長期根層土壤微生物的菌群結構進行分析,旨在為進一步了解鹽堿土壤微生物的多樣性、結構、功能與演化等問題,以及維護鹽堿地生態系統的穩定平衡提供土壤微生物方面的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點選擇

試驗地點分別設置在山東省花生研究所萊西試驗田和東營市不同地理位置的利津縣汀羅鎮毛坨村和墾利縣青坨村,萊西市地處東經120°12′—120°40′,北緯36°34°—37°09′,東營市為東經118°07 ′—119°10′,北緯36°55′—38°10′。萊西試驗田土壤類型為潮土,東營市利津縣汀羅鎮毛坨村和墾利縣青坨村的土壤類型均為鹽化潮土。

1.2 試驗設計

田間條件下,以非鹽堿土壤平作花生田為對照,設置不同含鹽量土壤花生平作、花生/棉花間作兩種種植方式,花生播種日期均為5月10日,田間管理均同于一般高產花生田和棉花田。

土壤含鹽量差異以東營市不同地理位置的利津縣汀羅鎮毛坨村和墾利縣青坨村兩處不同含鹽量土壤為試材,以山東省花生研究所萊西試驗田的中等肥力非鹽堿土壤為對照。于花生生長旺盛期(莢果膨大期、8月13日)分別采集各種植方式下,花生根層和棉花根層0—20cm、20—40cm的土壤樣本。

1.3 土樣采集

于花生莢果膨大期(2015/8/13),同時分別采集不同試點花生根層(距花生、棉花主根10—15cm 處)0—40cm的多點混合土壤樣本(表1)。土壤樣品采集方法采用“S”型5點混合樣本法,分別采集各處理0—20cm、20—40cm的土壤樣本,將每個樣點同一層次的土樣混合均勻后,立即裝入無菌袋中,置于-20℃冰箱保存備用。

表1 供試土壤樣品性狀與處理

有機質含量(Organic matter content，OM)；土壤陽離子交換量(Cation exchange capacity，CEC)

1.4 土壤DNA提取

收集所得土壤樣品利用OMEGA土壤總DNA提取試劑(OMEGA soil DNA kit)盒進行提取。所得DNA采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000分光光度計檢測DNA的純度和濃度。

1.5 16S rRNA文庫構建及高通量測序

稀釋后的基因組DNA利用引物340F：CCTACGGGNBGCASCAG以及805R：GACTACNVGGGTATCTAATCC對16S rRNA基因的V3-V4區進行擴增。擴增程序如下：95℃預變性3min；30個循環包括(95℃,30sec；50℃,30sec；72℃,60sec)；72℃,7min。PCR 產物使用1.5%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR產物濃度進行等濃度混樣,充分混勻后使用0.5×TBE濃度1.5%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產物,割膠回收目標條帶。產物純化試劑盒使用QIAGEN公司的MinElute膠回收試劑盒。最后使用HiSeq2500進行250PE測序。

1.6 生物信息學分析

測序得到的原始數據(Raw Data),存在一定比例的干擾數據(Dirty Data),為了使信息分析的結果更加準確、可靠,使用SOAPdenovo對原始數據進行拼接、過濾,得到有效數據(Clean Data)。

然后基于有效數據進行OTUs(Operational taxonomic units)聚類和物種分類分析,并將OTU和物種注釋結合,從而得到每個樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結果。再對OTUs進行豐度、多樣性指數等分析,同時對物種注釋在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。最后在以上分析的基礎上,可以進行一系列的基于OTUs、物種組成的聚類分析,PCoA和PCA統計比較分析,挖掘樣品之間的物種組成差異,并結合環境因素進行關聯分析。

2 結果與分析

2.1 樣本的有效序列數據量和物種豐度統計

表2看出,供試樣本序列條數在1716596—2863616間,花生6樣品序列條數最小,花生4樣品最大,10個樣本的序列條數和有效序列條數總和分別為21617593、16497920。在樣品相似度為0.97的情況下進行多樣品物種豐度統計,21617593條序列中有16497920條序列相似性標準匹配到參考數據庫,共分為21736個OTUs,樣品中物種分布的均勻度為76.32%。

表2 土壤樣本的有效序列統計

2.2 Alpha多樣性分析

表3所示,10個樣本的goods_coverage測序深度指數均在99.83%以上,估計群落中OTUs個數的chao1和ACE菌群豐富度指數分別在11461.02—15167.3和11317.56—15010.0間,Shannon多樣性指數為9.01—10.29,Simpson指數均大于0.9932,PD whole_tree指數為181.32—254.29,Observed_species指數均在9050個以上。除花生1樣品的Shannon多樣性指數相對最大外,花生2樣品的chao1和ACE菌群豐富度指數、Simpson指數、PD_whole_tree指數和Observed_species指數均最高,而花生5和花生6樣品中chao1和ACE菌群豐富度指數、Shannon指數、Simpson指數、PD_whole_tree指數和Observed_species指數均較小。可見,黃河三角洲濱海鹽堿土壤中無論是花生平作還是花生/棉花間作的種植方式,花生、棉花0—40cm根層土壤微生物種類和優勢種群的數量豐富,土壤微生物群落功能多樣性較非鹽堿土壤花生根層微生物群落豐富,尤以土壤含鹽量較高的花生平作種植方式下花生1和花生2樣本更為豐富。

2.3 鹽堿地土壤花生根層微生物群落結構分析

2.3.1在門級別的菌落結構分析

圖1可以看出,無論是不同鹽堿程度土壤還是不同種植方式,花生、棉花根層土壤微生物類群從門水平上均可歸為11個菌門,其中以變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteria)等4種為主要菌群,其總豐度占80%—90%,并尤以變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)相對豐度最大,二者豐度高達70%—80%。但鹽堿土與非鹽堿土兩土壤類型間,其土壤微生物主要優勢類群豐度在門水平上存在差異,花生和棉花間作種植方式基本不影響二者0—40cm根層土壤微生物優勢類群。花生3、花生4、花生5、花生6和花生8土壤樣品中變形菌門(Proteobacteria)豐度較低,在26%—31%間,以花生4最低；花生1、花生2和花生9樣品中變形菌門(Proteobacteria)豐度較高,在39%—43%間,且以花生1中最高。放線菌門(Actinobacteria)的豐度值以花生3、花生4、花生7和花生8土樣較高,在43%—50%間,其余土樣的豐度值相近,均在32%—40%間。花生5、花生6兩樣本酸桿菌門(Acidobacteria)豐度為16%—20%,顯著高于其他8個土壤樣本的3%—8%,但其綠彎菌門(Chloroflexi)豐度僅為2%—4%,顯著低于其他樣本。花生3、花生4、花生5、花生6樣本的厚壁菌門(Firmicutes)豐度較高且花生4樣本的豐度達12%以上,是其余樣本豐度的3—6倍。青島萊西非鹽堿土壤0—40cm花生根層酸桿菌門(Acidobacteria)豐度值遠高于其他土壤根層樣本,但綠彎菌門(Chloroflexi)豐度明顯低于其他土壤樣本。

表3 土壤樣本多樣性分析指數

圖1 各樣本在門水平的菌落結構柱狀圖 Fig.1 Histogram of microflora structure from ten samples at the level of phylum

鹽堿土壤0—20cm花生根層和棉花根層土壤中,變形菌門(Proteobacteria)豐度均高于20—40cm土層中,其余優勢菌群在土壤類型和不同作物根層0—40cm土層間分布差異不明顯。不同土壤類型間的優勢菌群豐度存在較大差異,中度鹽堿土以變形菌門(Proteobacteria)豐度值較高,輕度鹽堿土和非鹽堿土花生根層以放線菌門(Actinobacteria)豐度較高,酸桿菌門(Acidobacteria)主要分布于非鹽堿土壤的花生根層。

2.3.2在綱和目級別的菌落結構分析

圖2可以看出,無論是不同含鹽量的鹽堿土壤還是非鹽堿土壤,其細菌主要有α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、酸微菌綱(Acidimicrobiia)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、纖維粘網菌綱(Cytophagia)和芽孢桿菌綱(Bacilli)等10種菌群,此10種菌群在鹽堿土壤中的豐度為80%左右,在非鹽堿土壤中的豐度略低為70%；兩類土壤中均以 α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和放線菌綱(Actinobacteria)的豐度較高,二者占40%—55%；非鹽堿土壤花生根層中的嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)的豐度高于鹽堿土壤3倍以上,其γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和酸微菌綱(Acidimicrobiia)均明顯低于鹽堿土壤花生、棉花根層3倍以上；高含鹽量鹽堿土壤的平作花生根層和花生//棉花間作的花生及棉花根層的芽孢桿菌綱(Bacilli)均明顯低于非鹽堿土壤。

由圖2可知,放線菌目(Actinomycetales)是鹽堿地花生平作和花生//棉花間作方式下二者根層土壤中的主要優勢菌群,其豐度在20%—32%,而非鹽堿土壤中僅為15%—20%；其次為根瘤菌目(Rhizobiales),其在各類型土壤、不同種植方式下的花生根層和棉花根層均在5%—14%；鹽堿土壤中的酸微菌目(Acidimicrobiales)高于非鹽堿土壤的5倍以上,但其中Gaiellales菌目低于非鹽堿土壤的5倍以上；紅螺菌目(Rhodospirillales)在各類型土壤中幾乎無差異,均占5%左右；鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)在花生//棉花間作種植方式下明顯升高,相對豐度在5%左右,而其余類型土壤樣品中僅占2%—3%；其余諸如假單胞菌目(Pseudomonadales)、紅桿菌目(Rhodobacterales)、土壤紅桿菌目(Solirubrobacterales)、黏球菌目(Myxococcales)等菌群在不同類型鹽堿土壤和非鹽堿土壤間豐度優勢差異不大,其相對豐度總和不足10%。

圖2 土壤樣本在綱、目級別的菌落結構柱狀圖Fig.2 Histogram of microflora structure from ten samples at the level of class and order

2.3.3在科級別的菌落結構分析

由圖3可知,不同類型鹽堿土壤和非鹽堿土壤花生根層、花生//棉花間作的棉花根層,土壤微生物菌群在科級別的優勢菌群差異主要表現在類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)、生絲微菌科(Hyphomicrobiaceae)、紅螺菌科(Rhodospirillaceae)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)和放線菌科(Gaiellales)等5種微生物類群,其中,非鹽堿土壤中的類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)顯著低于鹽堿土壤的5倍以上,而其放線菌科(gaiellales)遠高于鹽堿土壤的5倍以上,紅螺菌科(Rhodospirillaceae)略高于鹽堿土壤的2倍左右,其余諸如黃單胞桿菌科(Xanthomonadaceae)、中華桿菌科(Sinobacteraceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、布魯氏菌科(Brucellaceae)、放線菌目的小單孢菌科(Micromonosporaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)等6種土壤微生物菌群相對豐度總和在10%左右。可見鹽堿土壤花生根層土壤中放線菌科(gaiellales)的相對豐度顯著降低,而類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)的相對豐度顯著增加。

圖3 土壤樣本在科級別的菌落結構柱狀圖 Fig.3 Histogram of microflora structure from ten samples at the level of family

2.3.4在屬級別的菌落結構分析

圖4可見,無論是花生平作、還是花生//棉花間作,鹽堿土壤花生根層和棉花根層土壤微生物種類、優勢種群數量和群落功能多樣性在屬級別較非鹽堿土壤豐富,主要為鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)、紅游動菌屬(Rhodoplanes)、假單胞菌(Pseudomonas)、紅平紅球菌(Rhodoococcus)等,鹽堿土壤樣品中除嗜酸細菌類群如CandidatusKoribacter、Actinomadura、Phycicoccus和CandidatusSolibacter豐度較低外,其余類群均較豐富。而非鹽堿土壤樣品中Rubellimicrobium、Iamia、Pontibacter、Inquilinus菌群豐度極低外,Steroidobacter、Lysobacter、Actinomadura、Pseudochrobactrum、Afifella和Catenuloplanes均較低,且CandidatusSolibacter豐度顯著高于鹽堿土。非鹽堿土壤0—40cm土層中均未發現Rubellimicrobium屬和Pontibacter屬細菌,且0—20cm土層中無Lamia屬細菌。鹽堿土花生根層土壤微生物在屬水平上更為豐富。

圖4 土壤樣本在屬級水平的菌落豐度變化圖Fig.4 Histogram of microflora structure from ten samples at the level of genus

2.4 Beta多樣性分析

由圖5可知,主成分1(PC1)可以解釋所有變量方差的47.02%,主成分2(PC2)可以解釋所有變量方差的11.55%,前兩個主成分共解釋了總變異的58.57%,第3至第10主成分的方差貢獻率較小,均低于10.0%,尤其第10主成分的方差貢獻率接近0(圖5)。表明不同來源的10個土壤樣品在PC1和PC2上均存在明顯的空間分異,10個土壤樣品的土壤微生物群落可明顯分為3簇：花生5、花生6樣品聚為一簇,花生2和花生4聚為一簇,其余花生1、花生3、花生7、花生8、花生9和花生10為一簇(圖5)。花生5、花生6樣本與其他樣本的相似度差異較大,其與第一、二主成分均為正相關關系,而其余鹽堿土花生//棉花根層土壤微生物類群均與第二主成分相關性較高,其中,花生3、花生5、花生7和花生9土壤微生物菌群與第二主成分為正相關關系,花生1、花生2和花生4土壤微生物菌群則與第二主成分為負相關關系(圖5)。表明,土壤類型對土壤微生物類菌群類型影響較大,10個土壤樣本依據土壤含鹽量高低和根系分布深度聚為3類,即非鹽堿土壤歸為1類,鹽堿土壤根系密集分布層0—20cm、20—40cm各歸為1類,花生//棉花間作下的花生或棉花根層不影響其土壤微生物菌群類型。OTU豐度聚類僅與土壤類型和鹽堿土壤根系密集分布層深度有關,而與其花生//棉花間作下的花生或棉花根層無關。

圖5 土壤微生物主成分分析Fig.5 Microbial principal component analysis

3 討論

鹽度和堿度是影響不同鹽堿程度鹽堿土壤中微生物群落結構的顯著因素,土壤電導度(EC)和pH對鹽堿土壤細菌群落結構的影響力最大,極端鹽堿土壤中分布著大量的喜鹽堿細菌,非耐鹽堿細菌不占有優勢[16-19]。鹽堿地土壤細菌具有豐富物種、遺傳和發育系統多樣性,不同鹽堿程度土壤中的主要細菌為耐鹽堿的細菌菌株,并且均是耐硫酸鹽的細菌。變形菌綱(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌和δ-變形菌綱)是鹽堿土壤的主要類群,其余依次是放線菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和疣微菌門,Marinobacter,Halomonas和Pseudomonas這些嗜鹽菌普遍存在于鹽堿土中[16- 19]。天津濱海鹽堿土壤細菌以乳桿菌屬、芽孢桿菌屬為主,放線菌以鏈霉菌屬占優勢,真菌以青霉屬為主[20]。本試驗條件下,土壤類型、含鹽量高低均影響0—40cm根層土壤微生物活性、菌落結構、功能類群和根層土壤微生物群落多樣性。黃河三角洲濱海鹽堿土壤中花生//棉花間作種植方式下,花生和棉花根層土壤微生物種類和優勢種群的數量、群落功能多樣性均較中等肥力非鹽堿土壤平作花生根層微生物群落豐富,尤以較高含鹽量土壤中更為豐富。

生物改良措施是通過種植植物,增加地表覆蓋面積,減少地表水分蒸發,增加土壤根系數量及微生物活性,從而改善土壤理化性質。生物改良措施被認為是最具生態效益和經濟效益的措施,同時也是國內外鹽堿地治理的發展趨勢之一。關于不同植被(植物)尤其是鹽生植物對鹽堿地微環境、植物生長季養分吸收等因子對土壤改良的響應已有較為系統的論述[21],有關生物措施對鹽堿土壤微生物群落結構的影響研究表明,松嫩草地不同植被覆蓋下土壤微生物數量存在較大差異。羊草群落土壤細菌、真菌和放線菌數量較蘆葦群落、虎尾草群落、堿茅群落、堿蓬群落以及鹽堿裸地均有所提高[22]。

在黃河三角洲鹽堿環境中種植一定種類的鹽生植物,會提高微生物的種類、數量和種群變化,而且檉柳對微生物的影響較大,且耐鹽細菌的比例顯著下降,隨著連續種植時間的增加,微生物總數的減少以及真菌數量的增加,細菌與真菌的比值顯著變小,并且氨化細菌、自生固氮菌、硝化細菌和亞硝化細菌等生理類群微生物的數量也逐漸下降[23]。馬旭龍等[24-25]研究結果表明,鹽堿地種植油葵、甘草、錦雞兒等植物可改善鹽堿地根際土壤微生物的群落組成,優化鹽堿地微生物的群落結構,顯著提高土壤微生物群落功能多樣性,且不同植物品種對鹽堿地微生物群落結構的作用存在差異,可篩選出更適宜改善鹽堿地土壤質量的植物品種,也是鹽堿地生態恢復的一項有效措施。不同含鹽量的鹽堿土和非鹽堿土中,花生、棉花根層土壤微生物均以變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteria)等4種菌群為優勢菌群,其總豐度占80%—90%,尤以變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)相對豐度最大,二者高達70%—80%。鹽堿土花生和棉花根層芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度顯著高于非鹽堿土壤約2倍；非鹽堿土壤花生根層酸桿菌門(Acidobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)豐度是鹽堿土壤花生根層的3倍以上。鹽堿土壤花生、棉花根層γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和酸微菌綱/目(Acidimicrobiia)豐度是非鹽堿土壤花生根層的3—5倍,而非鹽堿土壤花生根層中的嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)和Gaiellales菌目(Thermoleophilia)的豐度是鹽堿土壤3—5倍以上；鹽堿土壤花生和棉花根層Gaiellales菌目低于非鹽堿土壤的5倍以上,而酸微菌目(Acidimicrobiales)高于非鹽堿土壤的5倍以上。類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)在鹽堿土壤中的豐度高于非鹽堿土壤的5倍以上,而放線菌科(Gaiellales)低于鹽堿土壤的5倍以上；非鹽堿土壤0—40cm土層中均未發現Rubellimicrobium屬和Pontibacter屬細菌,且0—20cm土層中無Lamia屬細菌,與前人研究結果基本一致[10,26-29]。本研究所選土壤類型雖均為潮土類,其所處地理位置基本相同,但土壤耕種歷史和利用方式的差異,亦會影響本研究條件下的花生、棉花根層土壤微生物的菌群結構,加之,土壤樣品的生物學重復少,其代表性可能有一定的局限性。因此,有關鹽堿土花生根際土壤微生物活性、菌落結構、功能類群、與非鹽堿土花生根際微生物群落多樣性及功能的差異,以及發掘利用還有待深入研究。

4 結論

試驗結果表明,黃河三角洲濱海鹽堿土高含鹽量土壤中根際土壤微生物種類、優勢種群數量和群落功能多樣性較非鹽堿土壤豐富,尤以土壤含鹽量較高土壤更為豐富。黃河三角洲濱海鹽堿土中以變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteria)等4種菌群為優勢菌群,其總豐度占80%—90%。鹽堿地花生//棉花間作影響二者根層微生物群落的組成,花生單作根層土壤厚壁菌門(Firmicutes)豐度是花生//棉花間作花生根層的5—6倍,但間作條件下,花生根層土壤變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)豐度值均低于花生單作根層土壤豐度值5%左右。土壤類型對土壤微生物菌群類型影響較大,依據土壤含鹽量高低和根系分布深度聚為3類,即非鹽堿土壤歸為1類,鹽堿土壤根系密集分布層0—20cm、20—40cm各歸為1類。鹽堿土的培肥改良和作物增產與作物根際微生態環境密切相關,鹽堿土根際微環境的改變與農藝措施的關系有待深入研究。