酶水解-液相色譜法測定嬰幼兒食品中的色氨酸

孫立臻，別梅，馮峰，王駿，祝建華，劉艷明，張峰

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，濟南250100；2.山東省特殊醫學用途配方食品質量控制工程技術研究中心，濟南250100；3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京100176）

0 引言

L-色氨酸（L-Tryptophan）是人體必需的一種氨基酸[1]，嬰幼兒如果缺乏色氨酸，會導致其蛋白質和脂肪代謝障礙，影響其正常的生長發育[2-3]。我國的標準[4-5]中，均規定嬰幼兒食品中允許添加L-色氨酸，并對含量有明確要求。但我國缺乏相關產品中色氨酸的檢測標準，使政府監管和企業質量控制難以有效開展。

目前國內外對于乳粉中色氨酸的檢測的報道較少，對特殊醫學食品中色氨酸的檢測的報道幾乎沒有。已有的色氨酸的檢測方法主要有分光光度計法[6-7]、離子交換色譜法[8]、液相色譜[9-10]和液-質聯用法[11]等方法，前處理過程一般為堿水解法[12-14]，堿水解法水解產物復雜、重現性差、靈敏度較低[15]。本研究建立了一種準確測定嬰幼兒食品中色氨酸含量的酶解-高效液相色譜法。該法準確度高、重現性好，對N IST標準乳粉（1849a）的測定結果滿意，可用于市售嬰幼兒配方乳粉及醫學食品中色氨酸含量的檢測，為乳粉和醫學食品中色氨酸的監管提供了技術支持。

1 實驗

1.1 材料與試劑

L-色氨酸標準品Bepure；XBridge C 18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3.5μm)；甲醇(色譜純)；T ris堿；鹽酸；乙酸；氫氧化鋰；蛋白酶；N IST乳粉標準品（1849a）；乳粉和醫學食品。

1.2 儀器與設備

Waters e2695高效液相色譜儀(配備熒光檢測器2475和二極管陣列檢測器2998)；AB204-S型電子天平；SB-800DTD型超聲波清洗器；3-18K型冷凍離心機；Milli-Q超純水制備器；渦旋混合器；DNP-9162BS-III電熱恒溫培養箱。

1.3 試劑的配制

1.3.1 L-色氨酸標準溶液的配制

準確稱取10 m g（精確到0.1 m g）L-色氨酸標準品于10 m L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。然后用水逐級稀釋到質量濃度為0.2～100μg/m L，臨用前配制。

1.4 色譜條件

W aters Xbridge C 18色譜柱(3.5μm，150 mm×4.6 mm)；流動相：A為甲醇，B為0.1%乙酸；流速0.8 m L/m in；進樣體積10μL；激發波長295 nm，發射波長345 nm；柱溫35℃；等度洗脫條件為：甲醇0.1%，乙酸水=10∶90。

1.5 樣品處理

1.5.1 游離色氨酸的測定

稱取混合均勻的固體試樣500 m g（精確到0.1 m g）于50 m L刻度管中，加入2 m L水，超聲溶解，加入12 m L甲醇，充分混勻沉淀蛋白，用水定容至50 m L刻度，冷凍離心，濾液經0.22μm微孔濾膜過濾，液相色譜測定。

1.5.2 色氨酸總量的測定（酶水解法）

稱取混合均勻的固體試樣200 m g（精確到0.1 mg）于50 m L帶螺紋的離心管中，加入0.5 m L蛋白酶溶液（質量濃度5 mg/m L），3.0 m L Tris堿緩沖液（濃度為0.1 m o l/L，p H=8.5），200μL甲醇，超聲溶解，混合均勻，于50℃恒溫培養箱中18 h至酶解完全待樣品冷卻至室溫，加入12 m L甲醇。用水定容至50 m L，混勻后冷凍離心，濾液經0.22μm微孔濾膜過濾，液相色譜測定。

1.5.3 色氨酸總量的測定（堿水解法）

稱取混合均勻的固體試樣200 m g（精確到0.1 m g），置于帶螺紋的聚四氟乙烯水解管中，加5 m L濃度為4 mol/L的氫氧化鋰溶液，充氮氣后，旋緊蓋子，放入(110±1)℃恒溫干燥箱，水解20 h。冷卻至室溫，混勻開管，用水將水解液定量地轉移到50 m L刻度管中，濃度為6 m ol/L的鹽酸溶液調節pH值到中性，并用水定容至刻度，混勻后冷凍離心，濾液經0.22μm微孔濾膜過濾，液相色譜測定。

1.5.4 空白實驗

除不加試樣外，其他操作步驟同試樣的操作步驟。

2 結果與討論

2.1 水解方式的考察

本研究選取嬰幼兒配方乳粉和醫學食品進行了堿水解法和酶水解法的對比，表1結果表明，酶水解法的測定結果（扣除空白值）均不同程度的高于堿水解法的結果。乳粉的測定結果差異較小，在6.3%～9.0%之間；醫學食品的測定結果差異較大，在6.0%～21.2%之間，差異最大的是含有大量游離色氨酸的氨基酸配方醫學食品，其次是添加了不同程度水解乳清蛋白粉的深度水解配方醫學食品和部分水解配方醫學食品，而無乳糖配方、早產兒配方和全營養配方的醫學食品測定結果差異稍小。

根據產品標簽分析，氨基酸配方和部分/深度水解配方的醫學食品中添加的是游離色氨酸和經過不同程度水解得到的小分子肽段，高濃度的堿液對其具有不同程度的破壞作用，導致其結果比酶水解法偏低很多；其余幾種配方的醫學食品與乳粉的基質類似，調整的僅是維生素、礦物質等營養指標，故其測定結果的差異程度與乳粉類似。無論是從操作的簡便程度，還是結果的準確度上考慮，酶水解法都更適用于乳粉和醫學食品中色氨酸的測定。

表1 堿水解法與酶水解法的結果對比

2.2 酶解條件的優化

2.2.1 酶解溫度

以標準乳粉1849a（（184±10）m g/100g）作為實驗樣品，固定酶的加入量（0.5 m L）和酶解時間（18 h），分別考察反應體系在40，45，50，55，60℃等不同溫度下的結果；結果表明，當酶解溫度為50℃，達到酶解峰值，如圖1所示。

2.2.2 酶解時間

以標準乳粉1849a作為試驗樣品，固定酶的加入量（0.5 m L）和酶解溫度（50℃），分別考察反應體系在不同酶解時間（14，16，18，20，22，24 h）的結果。實驗結果表明，當酶解的時間超過16 h以后，結果趨于穩定，證明酶解充分。綜合時間、效率、準確度等因素，18 h為最佳的酶解時間，結果如圖2所示。

2.2.3 酶的用量

以標準乳粉1849a作為實驗樣品，固定酶解溫度（50℃）和酶解時間（18 h），分別考察酶的用量對結果的影響。結果均為扣除試劑空白以后的結果。實驗結果表明，當酶的用量超過0.5 m L以后，結果趨于穩定，綜合考慮到成本等問題，酶的最佳用量為0.5 m L，結果如圖3所示。

圖1 1849a在不同酶解溫度下的結果

圖2 1849a在不同酶解時間下的結果

圖3 1849a在不同酶用量下的結果

2.3 色譜條件的優化

2.3.1 色譜柱

本研究比較了Therm o Acclaim C 8（3.0 mm×150 mm，3μm），Waters Xbridge C 18（4.6 mm×150 mm，3.5μm），W aters Atlantis T 3（4.6 mm×250 mm，5μm）3種類型的色譜柱，驗證色氨酸的色譜保留行為。實驗結果表明，色氨酸在3種色譜柱條件下均能有很好的保留，從方法的適用性及普及性上考慮，C 18色譜柱更為常規和普及，故最終選擇Waters Xbridge C 18（4.6 mm×150 mm，3.5μm）柱作為分析柱。

2.3.2 流動相

本研究分別考察了甲醇-0.5 m o l/L磷酸二氫鈉緩沖鹽溶液（pH=2.3），甲醇-0.1%磷酸水溶液，甲醇-0.1%乙酸水溶液3種流動相體系，在合適的有機相洗脫條件下，均能夠很好的分離目標物，且無干擾，綜合考慮磷酸鹽容易堵塞色譜柱、不易沖洗等原因，最終選擇甲醇-0.1%乙酸水溶液作為流動相條件。

2.3.3 檢測器

L-色氨酸具有吲哚環的結構，因此在紫外檢測器和熒光檢測器上均有較強的吸收。L-色氨酸在219 nm和278 nm處均有較強的紫外吸收，光譜圖（見圖4）。考慮到219 nm附近的干擾較多，故選擇278 nm作為紫外檢測器測定波長。本研究分別考察了乳粉1849a在278 nm處的紫外色譜圖和激發波長295 nm，發射波長345 nm處的熒光色譜圖（見圖5）。結果表明，L-色氨酸在紫外檢測器和熒光檢測器上均具有良好的響應，目標峰處均無干擾。通過對樣品的測試表明，兩種檢測器的定量結果無差異，結果如圖6所示。考慮到熒光檢測器具有更強的特異性，故選擇熒光檢測器作為主要的定量手段，紫外檢測器作為輔助定性定量的手段，本研究的方法學數據均為熒光檢測器的結果。

圖4 L-色氨酸的光譜圖

圖5 L-色氨酸的色譜圖

圖6 紫外檢測器和熒光檢測器定量結果

2.4 方法線性及檢出限

在上述優化的實驗條件下，本研究考察了色氨酸在0.2～100μg/m L質量濃度范圍內的線性關系和相關系數，結果表明色氨酸在該濃度范圍內線性關系良好，線性回歸方程為

Y=388456X+36512，相關系數(r)大于0.9999。綜合考慮信噪比和儀器分析的線性范圍，確定方法的檢出限和定量限分別為1.5 m g/100g和5 mg/100g。本方法的靈敏度完全能夠滿足對乳粉和醫學食品中色氨酸的檢測需求。

2.5 精密度與回收率

本研究對乳粉1849a進行了6平行的測定實驗，并通過向樣品中添加低、中、高3個濃度水平的色氨酸標準溶液，使樣品中色氨酸質量分數分別為（284，684，1184）m g/100g，每個水平平行測定6次，按上述樣品制備方法操作，分別得到精密度和回收率。結果表明，本方法色氨酸的回收率在99.0%～105.3%之間，相對標準偏差(RSD)為1.52%～2.01%，結果如表2所示。這說明本方法完全能夠滿足實際樣品檢測的需求。

3 方法應用

本研究依照上述所建立的方法對購自市場和企業不同品牌、不同配方的國內外乳粉和醫學食品進行了測定。并分別比較了各種配方的樣品中游離色氨酸與總色氨酸的關系。

嬰幼兒配方乳粉中最常見的是牛奶粉和羊奶粉，奶粉中乳蛋白的水解是色氨酸的主要來源。本研究測定了來自不同品牌的5種牛奶粉和5種羊奶粉的色氨酸，結果如表3所示。多數奶粉中游離色氨酸的量低于定量限，說明樣品中的色氨酸來源于乳蛋白的水解。而牛奶粉5的游離色氨酸的量為25 m g/100g，樣品標簽顯示其添加了單體色氨酸，這與本研究的結果一致。

表2 L-色氨酸的加標回收率及精密度

特殊醫學用途嬰兒配方食品的常見配方有6種，包括氨基酸代謝障礙配方、乳蛋白深度水解配方、乳蛋白部分水解配方、全營養配方（母乳營養補充劑）、早產/低出生體重兒配方和低乳糖配方。本研究對6種配方的樣品進行了測定，并比較了游離色氨酸的比重，結果如表4所示。根據GB 25596規定，氨基酸代謝障礙配方中添加的是游離態氨基酸，包括L-色氨酸，研究結果顯示氨基酸代謝障礙配方中游離色氨酸占總色氨酸的99%以上；乳蛋白深度水解配方適用于食物蛋白過敏的嬰兒，不含有食物蛋白，添加成分為深度水解為氨基酸和肽段的乳清蛋白粉，研究結果顯示乳蛋白深度水解配方中既有游離態的色氨酸，也有水解色氨酸，游離色氨酸占總色氨酸的37.6%～61.4%；部分水解乳清蛋白粉配方添加的是經加工分解成小分子乳蛋白、肽段和氨基酸的乳清蛋白粉，會有少量游離色氨酸的檢出，這與本研究結果相吻合，游離色氨酸占總色氨酸的6.4%～10.8%；其他配方（無/低乳糖配方、早產/低出生體重兒配方和全營養配方）的醫學食品僅在普通乳粉的基礎上，對能量、乳糖、某些礦物質和維生素等的含量進行了調整，因此總色氨酸的量均來自于蛋白水解色氨酸，這與本研究的結果一致，這幾種配方的醫學食品中游離色氨酸的量均低于定量限。

表3 乳粉中游離色氨酸及總色氨酸的質量分數比對結果

表4 特殊醫學用途嬰兒配方食品中游離色氨酸及總色氨酸質量分數比對

4 結論

本研究通過酶水解法，建立了嬰幼兒配方乳粉和特殊醫學用途嬰兒配方食品中色氨酸的高效液相色譜法。該方法準確度好，靈敏度高。將該方法應用于實際乳粉和醫學食品的檢測結果表明，不同基質和配方的樣品之間，色氨酸的總量差異較大，游離色氨酸占色氨酸總量的比重也各不相同。本方法為制定嬰幼兒配方食品特殊醫學用途嬰兒配方食品中色氨酸的檢測標準提供了技術支持。