產蛋白酶乳酸菌發酵乳清蛋白產支鏈氨基酸的研究

王劍飛，李理，李寶磊，周晴晴，陳蘇，陳麗娥

(1.黑龍江省綠色食品科學研究院哈爾濱150028；2.杭州娃哈哈集團有限公司食品科學研究院生物工程研究所，浙江省食品生物工程重點實驗室，杭州310018)

0 引言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是廣泛被認為是安全的一類微生物。乳酸菌在乳中的生長依賴于自身的蛋白水解系統降解乳蛋白來滿足自身的生長需求[1]。乳酸菌產蛋白酶的性質對發酵乳的品質有重要影響，應用到發酵食品中，可以提高原料的酶解能力，產生許多風味物質前體和功能性成分—游離氨基酸，是篩選性質優良、穩定性強的工業生產菌株的主要指標[2]。支鏈氨基酸（branched am ino acid，BCAA），包括三種必需氨基酸，分別是亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，在人體中不能合成，需從食物中獲得。越來越多的證據表明，長時間的耐力運動主要是BCAA參與供能[3]。BCAA還可以促進運動中乳酸菌-葡萄糖循環以及糖異生的作用[4]，有利于減少骨骼肌中乳酸積累，延緩疲勞發生和促進運動后疲勞的消除[5]。

乳清蛋白是干酪加工過程中產生的副產品，以其易消化吸收、氨基酸組成合理、營養價值高等優點被稱為“蛋白之王”[6]。乳清蛋白中BCAA含量較酪蛋白豐富，本研究在前期篩選獲得一株高產蛋白酶的德氏乳桿菌乳亞種菌株的基礎上，將其應用于發酵乳清蛋白，并研究了不同發酵時間BCAA的變化情況。獲得的富含BCAA的發酵乳清蛋白液可作為運動飲料、發酵乳制品的功能性配料，提高產品附加值，具有良好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MRS液體培養基20.0 g葡萄糖，22.5 g胰蛋白胨，5.0 g乙酸鈉，2.0 g檸檬酸二銨，0.58 g硫酸鎂，2.37 g三水磷酸氫二鉀，0.28 g一水硫酸錳，0.5 g半胱氨酸，1.0 g吐溫-80，蒸餾水定容至1 000 m L，調節pH值至5.8，121℃高壓滅菌15 m in；改良MRS固體培養基，在液體培養基中添加1.5%的瓊脂，脫脂乳粉、全脂乳粉、脫鹽乳清粉（D 90）（恒天然（中國）有限公司）；濃縮乳清蛋白（丹麥ARLA乳品公司）；堿性蛋白酶2.4 L、風味蛋白酶Flavorzyme 1000L（諾維信（中國）生物技術有限公司）。

恒溫培養箱（德國賽默飛世爾科技公司）；M u ltitron Standard通用型震蕩培養箱（伊孚森生物技術（中國）有限公司）；M inifors Bacteria實驗室臺式標準發酵罐（伊孚森生物技術（中國）有限公司）；O ptim aTM XPN超速離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Christ真空冷凍干燥機（北京博勵有限公司）；氨基酸分析儀（安捷倫科技（中國）有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 產蛋白酶乳酸菌菌株

本研究所用菌株為實驗室自主分離于西藏山區當地農戶自制傳統發酵乳制品中，經篩選得到的一株具有較高蛋白分解能力的德氏乳桿菌乳亞種（下稱LB815）。該菌株現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為CGM CC N o.13750。

1.2.2 菌株高密度發酵條件確定

對培養基中碳源、氮源、發酵溫度、發酵pH值、通氣種類進行確定。

1.2.3 活菌數檢測

對發酵后的菌懸液直接進行生理鹽水梯度稀釋，并涂布于MRS固體培養基中，37℃恒溫培養24 h后，選擇菌落數為30～300的稀釋梯度進行計數。

1.2.4 高活性凍干菌粉制備

采用改良M RS液體培養基對菌株LB815進行活化與傳代（37℃，培養12 h），所得培養物經梯度稀釋后涂布于MRS固體培養基上，37℃培養至有單菌落形成，4℃保存備用。

取單菌落至10 m L M RS改良液體培養基，37℃培養12 h，所得培養物1%（體積比）接種至50 m L MRS改良液體培養基，37℃培養12 h，所得培養物1%（體積比）接種至200 m L MRS改良液體培養基，37℃培養12 h后將所得培養物全部接種于發酵罐中，37℃，恒定pH值（氨水調節）發酵18 h（對數生長后期）。發酵液8 000 r/m in，離心10 m in，收集菌泥，菌泥與保護劑按一定比例混勻后倒入平皿，至凍干機進行凍干。獲得的凍干菌粉進行活菌計數，并密封保存于-30℃備用。

1.2.5 發酵乳清蛋白液

配置質量分數10%的乳清蛋白溶液，均質后冷卻至43℃，接入LB815菌粉，調整活菌數為3.0×106cfu/m L，43℃靜止發酵24 h。4℃保存，檢測氨基酸含量，并進行感官評價。

1.2.6 氨基酸含量檢測

樣品前處理：準確稱量發酵乳樣品2.5 g，10%磺基水楊酸（0.02m o l/L HC l配置）定容至10 m L，室溫靜置10 m in后，取2 m L離心，離心得上清0.22 um有機濾膜處理后，待上機檢測。色譜條件及數據分析參考文獻方法[7]。

2 結果與分析

2.1 產蛋白酶菌株

菌株LB815在M RS固體培養基上可形成圓形、邊緣整齊的半透明菌。菌懸液在乳清蛋白水瓊脂平板上可形成明顯的水解圈，且水解圈直徑大于其他菌株，說明該菌株對乳清蛋白有較強分解能力[8]。

2.2 培養基中碳、氮源對菌株LB815生長的影響

根據前期API50實驗結果，以菌株LB815可利用的糖，分別為蔗糖、葡萄糖、海藻糖、果糖、乳糖和麥芽糖為碳源發酵，其他成分同M RS液體培養基。取菌懸液稀釋涂布，計活菌數，結果如圖1所示。

圖1 碳源對LB815生長的影響

以果糖為碳源，牛肉浸粉、酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨單體或復配（單體較好的兩種）為氮源，其他成分同MRS液體培養基。取菌懸液稀釋涂布，計其活菌數，結果如圖2所示。

圖2 氮源對LB815生長的影響

2.3 發酵溫度對菌株LB815生長的影響

設定發酵溫度為34、37、40、43℃，以果糖為碳源，牛肉浸粉和大豆蛋白胨為復合氮源，通N2，150 r/m in攪拌，pH值為5.5，進行發酵。取菌懸液稀釋涂布，計活菌數，結果如圖3所示。

2.4 發酵p H值對菌株LB815生長的影響

設定發酵控制p H值為5.0、5.5、6.0、6.5，溫度為37℃，以果糖為碳源，牛肉浸粉和大豆蛋白胨為復合氮源，通N2，150 r/m in攪拌進行發酵。取菌懸液稀釋涂布，計活菌數，結果如圖4所示。

圖3 發酵溫度對LB815生長的影響

圖4 發酵pH值對LB菌株815生長的影響

2.5 通氣種類對菌株LB815生長的影響

設定通氣種類分別為不通氣、CO2、N2，溫度為37℃，以果糖為碳源，牛肉浸粉和大豆蛋白胨為復合氮源，150 r/m in攪拌進行發酵。取菌懸液稀釋涂布，計活菌數，結果如圖5所示。

圖5 通氣種類對LB815生長的影響

綜合以上結果，菌株LB815高密度培養條件為：果糖為碳源、牛肉浸粉和大豆蛋白胨為復合氮源、發酵溫度37℃、pH值恒定為5.5、通氮氣。該發酵條件下，菌懸液活菌數為2.63×109cfu/m L，冷凍干燥后菌粉活菌數為2.93×109cfu/m L。

2.6 BCAA含量隨發酵時間變化情況

發酵過程中取樣檢測BCAA和總游離氨基酸含量，如圖6所示。結果發現，從發酵5 h開始積累BCAA至26 h達到最高值，隨后緩慢下降。3種氨基酸的組成，以亮氨酸最多，纈氨酸次之，異亮氨酸最少，BCAA總量最高可達到312.55 m g/kg。關于通過乳酸菌發酵乳清蛋白獲得BCAA的相關報道較少，王豪[9]等人，以生牛乳混合分離乳清蛋白為基料，發酵乳桿菌PCC為發酵菌種制備的發酵乳飲料中BCAA的含量僅為73.2 m g/kg。

圖6 BCAA隨發酵時間變化情況

3 結論

產蛋白酶的乳酸菌是重要的工業生產菌種，本研究對一株高產蛋白酶的德氏乳桿菌乳亞種LB815的高密度發酵條件進行優化和確定，為該菌株的工業化生產提供理論數據支撐。同時，將該菌株應用于發酵乳清蛋白，并考察不同發酵時間功能性成分—支鏈氨基酸含量的變化情況，為今后相關產品的開發奠定基礎。