OPO植物乳脂粉與幼兒糞便微生物體外互作益生效果評價

侯愛香，李珂，肖愈，李宗軍

(湖南農業大學a.食品科學技術學院；b.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室；c.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，長沙410128)

0 引言

OPO被作為一種顯著有效的功能成分被廣泛添加到嬰幼兒配方乳粉中，通常以OPO乳脂粉的形式添加，用棕櫚油和酶制成富含OPO（40%）的植物乳脂油，然后加入乳糖等成分，經乳化、干燥，制成粉劑，即富含OPO的植物乳脂粉（簡稱OPO乳脂粉）。對照國家食品安全標準GB1488-2012年食品營養補充使用標準，嬰幼兒配方奶粉OPO的添加量為24～96 g/kg，在此范圍內，多少濃度的OPO能更好的促進益生菌的生長并未明確。本研究以24月齡幼兒的糞便為菌源，研究不同濃度OPO乳脂粉24 h體外發酵過程中主要腸道微生物的變化情況，對雙歧桿菌、總厭氧菌、擬桿菌、梭狀芽孢桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌和總需氧菌進行計數，并計算對應的益生元指數PI和B/E值，評價不同濃度OPO-P的益生效果。

1 實驗

1.1 材料

OPO乳脂粉（OPO-P）：又稱富含OPO的植物乳脂粉，其中有質量分數50%植物精煉油（該植物精煉油為含有質量分數40%的OPO棕櫚油）；乳糖質量分數為41.63%；蛋白質質量分數為4.21%；水份質量分數3.72%；穩定劑、乳化劑、維生素、和礦物質等成分合計為0.44%。

糞便樣選擇主要參考文獻[1-2]中方法。選擇斷奶半年，均未食用OPO配方奶粉的24月齡3名幼兒為志愿者，幼兒2月內未服用抗生素，無腸道病史，采集3名志愿者的新鮮糞便。

含氮基礎發酵液為空白對照的基礎發酵液，其配方如下[3]：1 L水中含2 g酵母粉，2 g蛋白胨，2 g NaHCO3，4 m L質量濃度為0.025 g/100 m L的刃天青，2 m L吐溫-80，0.5 g膽汁酸鹽，0.5 g L-半胱氨酸，0.l g N aC l，0.05 g氯化血紅素，0.04 g K2HPO4，0.01 g M g-SO4-7H2O，0.01 g CaC l2.7H2O，10μL VK。

傳統培養技術采用的選擇性培養基：計數總厭氧菌的培養基為W ilkins and Chalgren瓊脂[4]；計數雙歧桿菌的培養基為BBL培養基[5]；計數乳桿菌的培養基為R ogosa培養基[6]；計數梭狀芽孢桿菌的培養基為Sulfite-polym yxin-milk瓊脂[7]；擬桿菌用擬桿菌礦物鹽瓊脂計數[8]；腸桿菌用紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂計數[9]；總需氧菌用營養瓊脂計數[10]。

1.2 儀器與設備

TP-213分析天平，SP500高壓蒸氣滅菌鍋，SW-CJ-2D超凈工作臺，YQX-I厭氧培養箱，SPX-250B-Z恒溫生化培養箱，C-1厭氧產氣袋，C-43圓底立式培養袋，旋渦振蕩器，XK 97-A菌落計數器。

1.3 方法

1.3.1 菌源處理

將所取糞便樣在厭氧操作箱中迅速解凍，將baby1，baby2和baby3糞樣各取10 g混勻，記為mixbaby，將mixbaby加入90 m L PBS緩沖液(pH=7.0)中稀釋，加無菌玻璃珠渦旋振蕩，使糞便充分分散。稀釋后的糞液用4層無菌紗布過濾，除去濾渣，取稀釋后的濾液為菌源，整個處理過程在1 h內完成。

1.3.2 OPO乳脂粉的厭氧發酵

通過查閱喬來艷[11]和XinZhang[2]等人做體外發酵研究的文獻，將他們所用的體外發酵方法進行改進，用于OPO乳脂粉對人體腸道微生物的影響研究。在37℃條件下，模擬人體腸道環境，配置對照組基礎發酵液和實驗組OPO乳脂粉發酵液，加入采集處理好的菌源，進行間歇式靜態厭氧發酵24 h，監測各發酵階段（0，4，8，12，24 h）微生物指標，對總厭氧菌、擬桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌和總需氧菌進行計數。

將菌源按接種量10%的量，分別加入空白組發酵液和實驗組發酵液中。研究以含氮基礎發酵液為空白組，以添加了不同濃度OPO-P的發酵液為實驗組。其中實驗組OPO的添加量參考國家食品安全標準GB1488-2012年食品營養補充使用標準“嬰幼兒配方奶粉OPO的添加量為24～96 g/kg”的要求，再結合實際沖泡奶粉時，一般常用的稀釋比為4.5 g奶粉兌30 m L水，分別以國標上限96 g/kg，中間質量分數50 g/kg和下限24 g/kg的添加量，在含氮基礎發酵液中加入OPO植物乳脂粉為實驗組，結合稀釋比在發酵液中折算成OPO的質量濃度，分別為3.6，7.5，14.4 m g/m L，分別記為3.6 m g/m L組，7.5 m g/m L組，14.4 m g/m L組。將空白組和各濃度實驗組發酵液分別分裝在Hungate厭氧滾管，置于37℃厭氧培養箱中發酵，所有試驗都進行3次生物學重復。

1.3.3 微生物檢測計數

參考Palfram an等人[12]和江南大學趙蘭濤[13]所用的腸道微生物計數方法，用傳統的稀釋平板法，選取合適梯度稀釋液100μL均勻涂布在7種選擇性培養基上。涂布后總厭氧菌、擬桿菌、雙歧桿菌和梭狀芽孢桿菌在37℃厭氧培養48～96 h后分別計數；乳酸桿菌、腸桿菌和總需氧菌在37℃,培養48 h后分別計數。

1.3.4 益生元指數計算

評價腸道菌群是否正常、平衡的重要指標有益生元指數，眾多研究者采納Palfram an等人的計算方法[12]，其計算公式如下：

式中：T，Bif，L，Bac，C分別指取樣時發酵液中總菌數、雙歧桿菌數、乳酸桿菌數、擬桿菌數、梭狀芽孢桿菌數量和接種時發酵液中總菌數、雙歧桿菌數、乳酸桿菌屬、擬桿菌數、梭狀芽孢桿菌數量的比值。

1.3.5 B/E值的計算

B/E值為腸道內雙歧桿菌和腸桿菌數量之比，計算公式為B/E=Bif/Ent。

1.3.6 數據處理

研究所有試驗均進行3次生物學重復，每個樣品進行了3次測定，數據通過Excel 2013軟件完成統理，結果以SPSS.21.0軟件的單因素分析方法（ANOVA）進行顯著性分析，兩兩比較采用最小差異法（LSD）,檢驗性水準a=0.05。

2 結果與分析

2.1 雙歧桿菌和乳桿菌變化結果

雙歧桿菌和乳酸桿菌通常作為腸道微生物有益菌的代表，通過添加不同質量濃度的OPO-P進行24 h體外發酵，將兩類菌的計數結果列表，如表1所示。

表1 體外發酵過程中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量統計結果 cfu·m L-1

表2 體外發酵過程中擬桿菌、梭狀芽孢桿菌和腸桿菌的數量統計結果 cfu·m L-1

由表1可以看出，所有發酵液，雙歧桿菌數都存在先上升后下降的趨勢。3個不同濃度OPO-P的添加，都能促進雙歧桿菌的生長繁殖，在發酵的前8 h內，雙歧桿菌數量與OPO-P的添加量成正比，添加的OPO-P濃度越大雙歧桿菌的數量越多，在發酵8 h的時候各組發酵液的雙歧桿菌數都達到最大值；在8～24 h的發酵階段，所有發酵液中雙歧桿菌數量都呈不同程度的下降，14.4 m g/m L濃度組發酵液中雙歧桿菌數下降幅度最大。3個不同濃度OPO-P的添加，都能大幅度的促進雙歧桿菌的生長繁殖，但促進作用與OPO-P的添加量沒有表現出特定的量效規律。同時，0 h的乳酸桿菌初始菌數水平較為一致，沒有顯著性差異。添加了OPO-P的3個發酵液乳酸桿菌數均呈先上升后下降趨勢，各組發酵液乳酸桿菌數均在12 h時達到最大，3個添加了OPO-P的發酵液在發酵前12 h內呈線性上升趨勢，12 h之后，均呈不同程度的下降趨勢，3.6 m g/m L組乳酸桿菌的下降幅度略大于14.4 m g/m L組和7.5 m g/m L組；但空白基礎發酵液整個發酵過程乳酸桿菌數均呈遞減趨勢。3個不同濃度OPO-P的添加，都能促進乳酸桿菌的生長繁殖，但促進作用沒有表現出特定的量效規律。

2.2 擬桿菌和梭狀芽孢桿菌變化結果

擬桿菌、梭狀芽孢桿菌和腸桿菌通常作為腸道菌群中無益菌群的代表，通過添加不同濃度OPO-P進行24 h體外發酵，三類菌計數結果如表2所示。

由表2可以看出，擬桿菌、梭狀芽孢桿菌和腸桿菌的菌數初始水平在各組中均無顯著性差異，擬桿菌和腸桿菌在4 h階段，各組發酵液菌數水平也無明顯差異。但后期發現，OPO-P對擬桿菌和梭狀芽孢桿菌均有一定的抑制作用，空白基礎發酵液這兩菌各階段的數量均高于實驗組發酵液，但抑制作用與OPO-P添加量沒有明顯的量效規律。OPO-P的添加在整個發酵過程中對腸桿菌數量沒有表現出一致的抑制或促進作用，在4 h和8 h階段，能促進腸桿菌的生長繁殖，之后呈現抑制作用，使腸桿菌數量呈不同程度的下降。

2.3 總厭氧菌與總需氧菌的變化結果

腸道微生物包括厭氧菌和需氧菌，通過添加不同質量濃度的OPO-P進行24 h體外發酵，將兩類菌的計數結果列表，如表3所示。

由表3可以看出,體外發酵24 h的過程中，所有發酵液中總厭氧菌數量與時間呈正相關，隨著時間的延續不斷遞增，且發酵前8h階段的遞增速度大于后期，添加了OPO-P的試驗組均高于空白的基礎對照組，添加量對總厭氧菌數量影響沒有明顯的量效規律。所有發酵液的總需氧菌總體呈上升趨勢，但在前8 h時呈線性上升趨勢，并在8 h時總需氧菌數量達到最大，8 h后呈不同程度的下降趨勢。

2.4 OPO-P添加量對PI值的影響

由于各個實驗組不可避免的有接種不均勻和初始菌數不一致的情況，單獨通過對各類菌群不同發酵時間段的菌落數進行比較來衡量營養素的益生作用存在偏差。因此，21世紀初Palframan等人提出了益生元指數PI，他們通過比較PI值的大小，定量描述試驗中各類低聚糖的益生效果。本研究借鑒使用PI指標，用以評價不同質量濃度OPO-P與嬰幼兒腸道微生物互作的益生作用。

表3 體外發酵過程中總厭氧菌、總需氧菌的數量統計結果 m L-1

由圖1可以看出，基礎發酵液空白組的PI值為負，不呈現益生作用。添加了不同濃度OPO-P的試驗組的益生元指數PI，都呈先上升后下降趨勢，且均在8 h階段達到最大值，說明3個質量濃度OPO-P的添加，都有明顯的益生作用，分批一次培養過程中，都在8 h階段益生效果最好。綜合比較，發現各時間段益生元指數最高的一組均為7.5 m g/m L組，以此評判該組益生效果最好，并在8 h階段PI值最大，達到2.73。研究中，益生效果與OPO-P的添加量不成嚴格的正比關系。這結果與微生物計數中雙歧桿菌數和乳酸桿菌數的結果并不完全一致。在雙歧桿菌計數過程中，由表1可以看出，發酵8 h階段，14.4 m g/m L組的雙歧桿菌數量最多，發酵12 h和24 h階段，14.4 m g/m L組的乳酸桿菌數量最多，但在圖1中PI在8,12 h和24 h階段都是7.5 m g/m L組最大，因為PI值還與這些時間段的擬桿菌數和梭狀芽孢桿菌數相關。

圖1 不同質量濃度OPO-P的益生元指數（PI）

圖2 不同質量濃度OPO-P的B/E值

2.5 OPO-P添加量對B/E值的影響

借鑒Van Der W aaij等以將B/E值作為腸道菌群定殖抗力指標的研究，本研究用B/E值反映幼兒腸道菌群結構，作為益生效果評價的補充指標。將表1中雙歧桿菌數量和表2中腸桿菌數量帶入計算公式，得B/E值如圖2所示。

若B/E＞1，表示腸道菌群中雙歧桿菌的水平高于腸桿菌科的水平；若B/E≤1，則表示腸道菌群中雙歧桿菌的水平低于腸桿菌科的水平，B/E越大說明腸道菌群越平衡，定殖能力越強，相應的益生效果越好。由圖2可以看出，空白組的B/E值在發酵的各個階段都小于添加了OPO-P的試驗組，說明沒有添加OPO-P的基礎發酵液體系中雙歧桿菌沒能迅速形成優勢菌。但在添加了OPO-P的所有實驗組中，B/E值都遠遠大于1，說明糞便樣品作為菌源，在發酵過程中雙歧桿菌迅速成為優勢菌，占有明顯的優勢地位，均顯示出明顯的改善腸道菌群的作用。但這種益生效果與OPO-P濃度的量效關系不固定，在0～8 h階段14.4 m g/m L組的B/E值最大，表現的益生效果最好，而最后12～24 h的階段7.5 m g/m L組的B/E值最大，表現出最好的益生效果。

3 討論

3.1 腸道微生物的檢測

本研究采用的傳統培養技術對腸道微生物中典型的有益菌、無益菌進行培養計數。傳統培養方法，設備要求簡單，實驗操作技術要求不高，試驗成本不貴，試驗周期也不長，數據直觀，數據處理簡單，是很多研究腸道微生物的學者經常采用的方法[14]。趙敏[15]、李艷莉[16]和曾艷華[17]等人先后用傳統培養技術研究了山萊英-熟地黃藥對與腸道菌群的相互作用、低聚糖對嬰兒腸道菌群的益生功能和中性大蒜果聚糖調節腸道菌群功能。但是這種方法也有很多局限，一是能培養的微生物種類有限，腸道微生物的類群多樣，不能準確的反映腸道菌群的真實情況；二是只能對樣品體系中的活菌進行計數，數據有所遺漏。因此，本研究中厭氧培養的擬桿菌、雙歧桿菌和梭狀芽孢桿菌的總數并不等于測得的總厭氧菌數，需氧培養的乳酸桿菌和腸桿菌之和也不等于測得的總需氧菌數。再此基礎上，為克服傳統培養技術的缺陷，有研究者改良腸道微生物計數的方法，如謝旻皓[18],張鑫[19]Vernazza[20]和Sánchez-Patán[21]等人采用FISH(fluorescence in situ hybridization)計數技術，來檢測腸道菌群的變化情況。隨著微生物檢測技術的發展，越來越多的研究者采用高通量測序的方法研究腸道微生物[22-23]。吳根梁[24]等人采用Illum ina M iSeq平臺高通量測序研究茶多酚對腸道微生物的組成、多樣性的影響，M inhao X ie等人[25]，利用16S rRNA高通量測序研究苦丁茶的有效成分二咖啡酰奎寧酸體外發酵對腸道微生物的影響；陳蕾[26]等人通過傳統培養技術之后進一步采用PCR-TGGE技術檢測苦蕎對腸道微生物多樣性的影響。因此，可以借鑒現代測序技術進一步研究OPO-P或OPO對幼兒腸道微生物的影響作用。

3.2 益生效果的評價

雙歧桿菌，乳酸桿菌通常作為腸道微生物中的有益菌，腸桿菌、梭狀芽胞桿菌和擬桿菌通常會被認為是無益菌，某種物質若能促進雙歧桿菌或乳酸桿菌的大量生長，或能抑制腸桿菌、梭狀芽胞桿菌和擬桿菌的生長，通常會被認為具有益生效果，能夠調節腸道微生物，促進腸道菌群平衡，彭春喜[27]，張寧[28]等人先后采用這種方法評價膳食纖維和大蒜果聚糖的益生功效。但這種方法無法避免接種不均勻、初始菌數不一致和體系中總菌數存在差異的實際問題，且無法確定營養素對有益菌的促進作用是否大于對無益菌的抑制作用，有益菌是否形成優勢菌定殖于腸道。因此，研究者們以B/E值、PI值等指數來評價益生效果，如Palfram an等人[12],用PI值評價低聚果糖的益生效果，趙蘭濤等人[13],以PI值評價全谷物對腸道菌群的益生作用，Van Der W aaij等人[29],用B/E值衡量益生效果。此外，曾艷華[17],改良Palfram an等人的計算方法，利用益生元活性分數來衡量益生效果，其計算公式如下：“益生元活性分數=[(24 h益生元培養基中的益生菌-0h益生元培養基中的益生菌)/(24 h葡萄糖基礎培養基中的益生菌-0h葡萄糖基礎培養基中的益生菌)]-[(24 h益生元培養基中的腸桿菌-0h益生元培養基中的腸桿菌)/(24 h葡萄糖基礎培養基中的腸桿菌-0h葡萄糖基礎培養基中的腸桿菌]”。其計算公式中的益生菌以雙歧桿菌和乳酸桿菌來計算，腸桿菌以大腸桿菌和腸球菌來計算。

此外，大量腸道微生物與膳食因子互作的研究通常還以代謝產物短鏈脂肪酸以及乳酸作為衡量膳食因子益生效果的指標之一。以增加短鏈脂肪酸產量特別是丁酸、乳酸產量，改變腸道p H值，作為益生指標，如Jelena Vu levic等人[30]，則將代謝產物乳酸納入影響因素，以益生元效果指數（M easurement of prebiotic effect M PE）來計算益生效果。本研究雖然結合了微生物計數、PI值和B/E值進行益生效果評價，還可以結合更多合適的指標進行進一步評價。

4 結論

本研究通過對腸道微生物中傳統的有益菌和無益菌進行分別計數，并結合益生元評價指標PI值和B/E值評估了國標范圍內不同質量濃度OPO-P的益生效果，兩者結合，比采用單一評價方式得出的結論更準確。研究發現不同質量濃度OPO-P都能有效調節腸道菌群，但7.5 m g/m L組益生效果最好，為嬰幼兒配方奶粉中OPO-P的高效添加提供了基礎研究數據。但本研究采用傳統培養技術對微生物進行計數有一定的局限性，益生效果評價的指標也有限，要獲得OPO-P或OPO益生效果更全面的評價，一方面可以采用高通量測序技術對微生物數量變化進行監測分析，另一方面還可以結合腸道微生物的p H值環境，短鏈脂肪酸、有機酸等代謝產物的產量和種類等指標進行更全面的評價。