外源ALA對NaCl脅迫下酸棗幼苗光合特性與膜脂過氧化的影響

常心怡,孫軍利,趙寶龍，李芳芳，劉連玲，何 旺

(1.石河子大學農學院/特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子832000;2 .新疆生產建設兵團綠洲生態農業重點實驗室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】截至2017年，紅棗種植面積已達50.45.67×104hm2，產量超過326×104t，位列國內各省首位[1]，棗產業在推動新疆經濟發展中發揮著重要作用[2]。新疆大面積的鹽堿土嚴重制約著紅棗產業的發展，通過用酸棗作砧木來嫁接紅棗以提高紅棗的耐鹽性[3]。酸棗(ZiziphusacidojujubaC.Y.Cheng et M.J.Liu)是鼠李科棗屬植物，它具有抗旱、抗鹽堿等的特點，是開發利用沙質荒地和鹽堿地的優良經濟樹種[4]。隨著新疆鹽堿面積的不斷增加，通過嫁接來提高耐鹽性的方法面臨挑戰，而外源調節劑對提高棗在鹽脅迫下的抗性有著重要作用。5-氨基乙酰丙酸(ALA)是生物體內葉綠素和光敏素等所有卟啉化合物生物合成的關鍵前體[5]，以多種方式參與多種植物體內代謝過程，并對植物的生長發育具有顯著的調節作用[6]。【前人研究進展】外源ALA可以調節植物葉綠素的合成和穩定，提高植物的光合效率，促進光合作用[7]，提高抗氧化能力，降低膜脂過氧化的損害程度[8]，增強植物對干旱[9]、鹽堿[10]、低溫[11]和弱光[12]等非生物脅迫的抗性，具有與植物激素類似的調節作用[8]。有關ALA研究表明，在NaCl脅迫下對小白菜葉片進行噴施外源ALA，可顯著提高葉綠素含量，緩解NaCl脅迫對小白菜光合能力的影響[13]。外源ALA可以提高低溫弱光下辣椒幼苗的抗氧化酶活性，減輕鹽脅迫對細胞膜的損傷，提高辣椒的抗寒性[14]。張春平等[15]研究表明，通過噴施外源ALA 能夠顯著提高鹽脅迫下決明子幼苗的抗氧化酶活性，并能提高決明子的光合效率，增強決明子幼苗的耐鹽性。【本研究切入點】目前關于噴施外源ALA溶液可以提高植物的抗性的相關研究在番茄[16]、葡萄[17-18]和蘋果[12,19]等多種植物上也有報道，但有關NaCl脅迫噴施外源ALA對酸棗幼苗葉片葉綠素含量、光合氣體交換特性及抗氧化酶活性的影響有待進一步研究。研究不同濃度ALA對NaCl脅迫后酸棗幼苗葉片葉綠素含量、光合氣體交換特性及膜脂過氧化的影響，【擬解決的關鍵問題】通過主成分分析法綜合分析，篩選出緩解NaCl脅迫的最佳ALA處理濃度，研究外源 ALA 緩解酸棗幼苗的調控機制，為酸棗在鹽脅迫下的生產栽培問題提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 酸棗與藥品

酸棗種子由陜北榆林佳縣提供。ALA由美國 Sigma 公司提供。

1.1.2 儀器設備

人工氣候箱(RXZ智能型，寧波江南儀器廠)，CIRAS-3型便攜式光合儀，冷凍離心機，紫外分光光度計。

1.1.3 培養

試驗于2015年7月到2016年10月期間在石河子大學農學院特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室進行。挑選整齊一致的酸棗種子，用清水在室溫(25℃)下浸種24 h；用0.5% KMnO4給種子消毒0.5 h；整齊擺放在墊有濕潤濾紙的發芽盒內；向發芽盒內加入適量蒸餾水以保持種子的濕潤度，待酸棗子葉展平后每天澆灌1/2倍Hoagland營養液。當幼苗長到2片真葉的時候，選擇長勢整齊，大小一致的幼苗移栽定植到裝有500 ml Hoagland營養液的水培盒19×13×11( cm)中，均在人工氣候箱(RXZ智能型，寧波江南儀器廠)內培養，種子發芽前采用全天黑暗，發芽后采用光照強度12 000 Lx，光照時長14 h，黑暗10 h，相對濕度保持在65%～70%；溫度25～28℃，每3 d 更換1次營養液。當幼苗長到6片真葉時開始試驗處理。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

采用前期預實驗篩選出的用鹽脅迫后酸棗表現出明顯鹽害癥狀的150 mmol/L NaCl濃度作為鹽脅迫濃度，為避免酸棗幼苗產生鹽激反應，NaCl濃度以每天50 mmol/L的濃度梯度遞增，在同一天達到目標NaCl濃度，在酸棗幼苗葉片上噴施不同濃度梯度的ALA溶液(記作第0天)。在處理后第3 d和第6 d測定光合相關指標并進行取樣，取完后放入-80℃冰箱保存樣品，用于生理指標的測定。表1

表1 酸棗幼苗的不同ALA濃度組合

Table 1 Different ALA concentration combinations in Jujube seedlings

處理TreatmentNaCl濃度NaClconcentration(mmol/L)ALA濃度ALAconcentration(mg/L)CK00NaCl1500T115050T215075T3150100T4150150

1.2.2 測定指標1.2.2.1 葉綠素含量

測定方法參考植物生理試驗指導書[20]。

1.2.2.2 光合氣體交換參數

光合指標用CIRAS-3型便攜式光合儀測定，選取自基部往上數的第5片完全葉為測定的對象，重復3次。分別于處理后第3 d、6 d上午10: 00 ～12: 00測定光合氣體交換參數，測定的指標包括凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)。

1.2.2.3 抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量

精確稱取0.2 g酸棗幼苗葉片，加入已預冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.8，含有1%PVP)進行充分研磨至勻漿狀態，定容到10 mL離心管中，10 000 r/min，4℃離心15 min，上清液為SOD、POD、CAT粗提液，每個處理需重復3次。參照Li等[21]的方法測定抗氧化物酶SOD、POD、CAT的活性。丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)檢測法[20]。

1.3 數據統計

采用SPSS19.0軟件進行方差分析(P<0.05)，用鄧肯氏法進行多重比較和差異顯著性檢驗，并對酸棗幼苗的11個單項指標的緩解系數進行主成分分析。利用Excel2010軟件進行數據的處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度ALA對NaCl處理下酸棗幼苗葉綠素含量的影響

研究表明,酸棗幼苗葉片葉綠素a(Chl a)的含量在第3 d和第6 d的各處理變化趨勢相似，即均在NaCl處理下比清水對照(CK)顯著降低，噴施不同濃度的ALA均能提高酸棗幼苗葉片的Chl a含量，并以T3處理增幅最大，除在第3 d的T3處理顯著高于CK，其他處理均低于CK，在相同處理下，第6 d Chl a的含量均低于第3 d。其中，與CK相比，NaCl處理下酸棗幼苗葉片Chl a在第3 d和第6 d分別顯著降低了36.01%和54.08%，在T3處理后分別顯著增加了67.50%和105.65%。

與CK相比，酸棗幼苗葉片中葉綠素b(Chlb)含量在NaCl處理下第3 d和第6 d分別降低33.84%和40.47%；噴施不同濃度的ALA后，除在第3 dT3處理高于CK，其他處理與CK均無顯著差異。與NaCl處理相比，酸棗幼苗葉片(Chl b)含量在T1～T4ALA處理后第3 d和第6 d分別顯著增加了65.81%～88.95%和39.27%～82.78%，且均以T3處理最高。在相同處理條件下，酸棗幼苗葉片的葉綠素含量均表現為第3 d高于第6 d。

酸棗幼苗葉片的總葉綠素Chl含量變化趨勢與Chl a趨勢相似，即在NaCl處理下酸棗幼苗葉片在處理后第3 d和第6 d分別比CK降低了35.49%和50.89%，而外源ALA處理后，T1、 T2和T3處理呈上升趨勢，T4處理略有下降外源ALA處理后，在T3處理下達到最大值，是NaCl處理的1.73和1.99倍，其中第3 d的值都顯著比第6 d高。

研究表明,NaCl脅迫下，酸棗幼苗葉片葉綠素的含量減少，合成受阻，噴施外源ALA可緩解NaCl脅迫對酸棗幼苗葉片葉綠素含量的影響，并以T3處理緩解效果最明顯，且在第3 d緩解效果較好。表2

表2 外源ALA對NaCl脅迫下酸棗幼苗葉綠素含量變化

Table 2 Effects of exogenous ALA on the Chlorophyll contents of sour jujube seedlings under NaCl stress

處理時間Treatmenttime(d)處理Trement葉綠素aChlorophyllacontent(mg/g)葉綠素bChlorophyllbcontent(mg/g)總葉綠素Chlorophyllcontent(mg/g)處理后第3dDay3aftertreatmentCK18.8±0.41b5.88±0.57ab24.68±0.65bNaCl12.03±0.34d3.89±0.1b15.92±0.44cT117.38±0.55bc6.45±0.52a23.83±1.07bT217.93±0.41bc6.78±0.53a24.71±0.94bT320.15±0.88a7.35±0.89a27.5±1.27aT416.7±0.34c7.02±0.83a23.72±1.17b處理后第6dDay6aftertreatmentCK18.12±1.04a5.56±0.22ab23.68±1.34aNaCl8.32±0.33d3.31±0.49b11.63±0.82cT114.14±1.2b4.61±0.54ab18.75±1.26bT215.64±0.08bc5.21±0.12ab20.85±0.2bT317.11±0.86ab6.05±1.08a23.16±1.24aT414.2±0.53c5.97±0.18a20.17±0.71b

注: 不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。CK：清水對照; NaCl：NaCl脅迫處理；T1、T2、T3和T4分別表示50、75、100與150 mg/L ALA濃度。下同

Note: Different letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level.CK: Clean water control.NaCl: NaCl stress treatment.T1, T2, T3 and T4 indicate 50, 75, 100 and 150 mg/L ALA concentration, respectively.The same as following

2.2 不同濃度ALA對NaCl處理下酸棗幼苗光合參數的影響

研究表明,與CK相比， NaCl處理下酸棗幼苗葉片中的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率在第3 d和第6 d顯著下降，分別降低了65.00%和71.67%、68.75%和75.60%及57.07%和80.51%；胞間CO2濃度顯著升高，分別提高了24.08%和34.45%。經不同濃度的ALA處理后，與NaCl處理相比，各濃度外源ALA處理酸棗幼苗葉片Pn、Gs和Tr在第3 d和第6 d均呈先增加后減少的趨勢；Ci呈先減少后增加的趨勢。其中，以ALA處理后第3 d的T3處理的效果最佳，分別增加了85.71%、135%和87.06%；Ci降低了22.53%。可見，鹽脅迫顯著影響了酸棗幼苗的光合作用效率，外源ALA可以顯著緩解鹽脅迫的傷害，并以T3處理效果最好。隨著處理時間的延長，ALA的緩解效果減弱。圖1

圖1 外源ALA對NaCl脅迫下酸棗幼苗光合參數變化

Fig.1 Effects of exogenous ALA on photosynthetic parameters in sour jujube seedlings under NaCl stress

2.3 不同濃度ALA對NaCl處理下酸棗幼苗抗氧化酶和丙二醛(MDA)含量的影響

研究表明,酸棗幼苗葉片中SOD在NaCl處理下第6 d顯著第與CK，而第3 d則與CK無顯著差異。噴施不同濃度的ALA后，均能不同程度的提高鹽脅迫下SOD活性；其中，在相同處理下，第3 d的鹽脅迫下酸棗幼苗葉片中SOD活性均高于第6 d，T1與T3間差異顯著，其他處理間差異不顯著。在第3 d，T3處理比NaCl處理顯著提高了20.79%。

酸棗幼苗葉片中POD活性在NaCl處理第6 d顯著比CK低18.91%，而第3 d則無顯著差異。不同濃度ALA處理酸棗幼苗葉片中POD活性大多比NaCl處理不同程度升高。其中，T1處理在第3 d酸棗幼苗葉片中POD活性顯著升高23.76%，T2處理在第3 d和第6 d分別顯著提高31.99%和24.20%，T3處理在第3 d和第6 d分別顯著升高69.59%和67.63%，T4處理在第3 d和第6 d分別顯著升高18.33%和26.43%。

NaCl處理下酸棗幼苗葉片中CAT活性與CK相比無顯著差異。與NaCl處理相比，噴施不同濃度ALA后，第3 d和第6 d分別增加了18.81%～61.25%和25.73%～51.46%，且均以T3處理最高。第3 d的增幅最大，且相同處理下第3 d的CAT活性均高于第6 d。

酸棗幼苗葉片中MDA在NaCl處理下第3 d和第6 d顯著比CK高82.04%和123.34%，與NaCl處理相比，外源ALA能顯著降低酸棗葉片MDA含量，以T3處理降低幅度最大，分別在第3 d和第6 d降低了24.71%和38.50%，第6 d的變化幅度最顯著。在相同處理條件下，外源ALA處理后第3 d的MDA含量均低于第6 d。

第3 d NaCl脅迫對酸棗幼苗SOD和POD活性無顯著影響，第6 d脅迫則誘導抗氧化酶活性顯著下降和MDA含量顯著提高，而外源噴施ALA顯著增強NaCl處理下抗氧化酶活性，降低其MDA含量，有效緩解NaCl脅迫誘發的過氧化傷害，并以T3處理緩解效果最佳，高于T3濃度反而削弱這種緩解效應。圖2

圖2 外源ALA對NaCl脅迫下酸棗幼苗葉片SOD、POD、CAT活性及MDA含量

Fig.2 Effects of exogenous ALA on POD, SOD, CAT activities and MDA contents in the leaves of sour jujube seedlings under NaCl Stress

2.4 不同濃度ALA對NaCl處理下酸棗幼苗耐鹽性的綜合評價

研究表明,根據特征值>1作為主成分個數原則，第1、第2主成分特征值分別6.952和3.5832，累計百分率達到95.78%，已對酸棗11個變量指標做了充分的概括，提取2個主成分。表3

表3 各指標篩選主成分

Table 3 Principal component analysis for indexes screening

主成分Principalcomponent特征值Eigenvalue百分率Proportion(%)累計百分率Cumulative(%)16.95263.200363.200323.583232.574795.7751

研究表明，第1主成分對Chl a、Chl b、Chl、Tr和Gs等有較大的得分系數，第1主成分主要是葉綠素含量決定；第 2 主成分的SOD、CAT和POD等有較大的得分系數，即第2主成分主要代表了抗氧化酶活性。綜合2個主成分所攜帶的信息，可以用Chl a、Chl、SOD和CAT 4個指標來概括11個指標中的大多數信息。各指標均有較高載荷，能夠較好地代表原始數據所反映的信息。

為了能夠更加直觀的評價外源ALA對酸棗幼苗耐鹽性的影響，根據主成分值進行排序，即對不同濃度ALA處理下酸棗幼苗的耐鹽性進行綜合評價，綜合指數越高，其濃度能更好地提高植株耐鹽性。設變量葉綠素a、葉綠素總量、葉綠素b、凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率、氣孔導度、超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和丙二醛的標準化后數據依次為X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10和X11，則得到主成分表達式：Y1=0.37X1+0.37X2+0.32X3+0.28X4+0.32X5+0.34X6-0.37X7+0.16X8+0.22X9+0.17X10-0.29X11；Y2=0.04X1+0.1X2+0.23X3-0.35X4-0.28X5-0.24X6-0.01X7+0.47X8+0.38X9-0.45X10+0.33X11；進行耐鹽性綜合評價時，可選取2個主成分，以每個主成分的方差貢獻率作為權重，構造綜合評價指數：F綜=0.632Y1+0.326Y2。表4

表4 主成分因子得分系數

Table 4 Component score confficient

指標Indexes第1主成分Component1第2主成分Component2葉綠素aChla0.9880370.068518葉綠素總量Chl0.9771870.187293葉綠素bChlb0.8531880.432595凈光合速率Pn0.745919-0.656436氣孔導度Gs0.834882-0.529199蒸騰速率Tr0.889014-0.453156氣孔導度Ci-0.97199-0.017667超氧化物歧化酶SOD0.4138130.895724過氧化物酶POD0.5798330.726871過氧化氫酶CAT0.4582090.84472丙二醛MDA-0.7661950.628865

得分由大到小依次為：T3>T2>T4>T1>CK>NaCl，其中外源ALA在T3處理下酸棗幼苗的耐鹽性最強。表5

表5 不同濃度ALA處理下酸棗幼苗耐鹽能力的綜合評價Table.5 Comprehensive evaluation of salt resistance of sour jujube seedlings under different ALA concentration treatments using principal component analysis

處理TreatmentF1ScoreofPC1F2ScoreofPC2F綜合Generalscore排序SortCK1.843-3.606-0.0115NaCl-4.860-0.392-3.1996T1-0.4380.8780.0094T20.6851.0650.7802T32.6601.6352.2141T40.1110.4210.2073

3 討 論

植物受鹽脅迫后，膜系統結構破壞，蛋白質合成能力及葉綠素的合成速率降低，致使葉綠素含量減少，光合能力減弱[22]。葉綠素是植物光合作用的主要因子，參與光能的吸收、傳遞和轉化[23]。前人研究中 ALA 是植物體內葉綠素生物合成前體[24-25]，低濃度ALA使得鹽脅迫下葡萄葉片能夠保持較高的葉綠素含量和光合速率[17]。研究表明，在150 mmol/L NaCl處理下葉片中的Chl a、Chl b和Chl的含量顯著降低，噴施不同濃度的ALA后，酸棗幼苗Chl a 、Chl b和Chl的含量均能不同程度的提高，且噴施ALA后第3 d和第6 d的變化趨勢相似。這與常青山[26]的研究結果一致。酸棗幼苗在NaCl脅迫下葉綠素分解，Chl a、Chl b和Chl含量下降，而噴施外源ALA緩解了NaCl脅迫對葉片中葉綠體膜及其結構完整性的損害，抑制了酸棗幼苗葉片中葉綠素分解的速度，維持了酸棗的光合速率的穩定，有效地緩解了NaCl脅迫對酸棗幼苗的影響。原因可能是由于ALA是葉綠素生物合成的前體物質，噴施外源ALA可以通過促進膽色素原 (porphobilinogen, PBG) 和尿卟啉原Ⅲ (uroorphyrinogenⅢ, UROⅢ) 等中間產物向下游轉化，促進葉綠素的合成[27]，試驗研究結果與之一致。

在鹽脅迫條件下植物的光合作用受到氣孔因素和非氣孔因素等多種因素的共同作用而被抑制[28]，當Ci與Gs具有同樣的下降趨勢時，Pn主要由于氣孔因素導致下降；當Ci增加而Gs減少時，則是由非氣孔因素引起Pn下降[29]。張春平[30]研究表明黃連幼苗葉片處在鹽脅迫條件時，鹽脅迫導致葉肉細胞光合活性的減弱，因此非氣孔限制因素是鹽脅迫下植物葉片光合作用降低主要因素，而外源ALA處理可以緩解鹽脅迫對黃連幼苗葉片光合作用的非氣孔限制，維持光系統的較高活性。研究結果表明，NaCl脅迫導致酸棗幼苗葉片Gs逐漸下降，Ci逐漸升高，說明鹽脅迫光合作用的主要限制因素是非氣孔因素。噴施外源 AIA減緩了NaCl脅迫下酸棗幼苗葉片Pn、Gs和Tr的降幅，Ci的增幅也顯著降低，表明ALA可以緩解NaCl脅迫對酸棗幼苗葉片光合作用的非氣孔限制，有助于調節植物葉片的氣孔正常開閉，從而促進CO2的交換，增強CO2同化能力，提高光合速率，維持光系統的穩定，這與常年春等[31]的研究結果一致。同時，研究還發現在100 mg/L ALA處理效果最好，處理前期(第3 d)緩解效果顯著，處理后期(第6 d)效果減弱。

植物通過把O2還原成H2O，為植物生長提供所需能量。但植株在長時間逆境作用時，O2不能被完全還原成H2O，導致植物體內積累大量活性氧，活性氧過量會引起膜脂過氧化，MDA積累量增加。此時植物細胞內的SOD就開始催化O2-轉變為H2O2，而后CAT和POD將H2O2分解為H2O和O2[32]，阻止膜脂過氧化作用持續發生。董榮榮等[33]認為亞適宜溫光下ALA可提高黃瓜幼苗中CAT、SOD和POD活性，并降低MDA含量。Poulos等[34-35]認為這可能與ALA轉化為有關，噴施ALA能促進亞鐵血紅素合成，增加過氧化物酶活性，從而提高植物對氧化脅迫的抗性，這與實驗的研究結果一致。試驗中，NaCl脅迫下，ALA處理后第3 d酸棗幼苗葉片SOD、POD和 CAT活性均高于CK，MDA含量增幅降低。外源ALA可顯著提高NaCl脅迫下的抗氧化酶酶活性，減少膜脂質過氧化程度，保持膜系統的完整性，增強植株抵御逆境的能力。

4 結 論

噴施不同濃度的ALA均會顯著緩解NaCl脅迫下酸棗幼苗葉綠素含量、Pn、Gs、Tr、SOD、POD和CAT的降低速度，能夠顯著降低Ci和MDA含量增加的速度。外源ALA處理后酸棗耐鹽性由強到弱為：T3>T2>T4>T1>CK>NaCl，即100 mg/LALA處理下能有效緩解鹽脅迫下酸棗幼苗光合特性和抗氧化酶的活性，并且處理后第3 d緩解效果優于第6 d。葉綠素a、葉綠素總量、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)可以作為評價外源ALA對NaCl脅迫緩解效應的主要指標。