硝態氮處理對雪菊幼苗生長及代謝的影響

秦亞楠，楊增強，趙志信，鄧霜霜，褚佳瑤，李志慧，買爾丹·買買提，秦 勇

(1.新疆農業大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業規劃研究院，烏魯木齊 830002)

0 引 言

【研究意義】雪菊，學名為兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)，又名昆侖雪菊、天山雪菊等，屬菊科金雞菊屬一年生草本植物[1]。雪菊是具有獨特功效的植物，我國野生雪菊主要生長于海拔3 000多m的昆侖山一帶，人工栽培主要在昆侖山北側的新疆和田地區。長期以來，雪菊被當地居民當花茶飲用，是一種具有廣闊前景和研究價值的藥用植物[2-3]。雪菊的主要代謝產物有多糖、蛋白質、有機酸、黃酮類物質等[4]，其藥理作用可能是多種代謝產物綜合作用的結果。氮素作為植物最重要的營養元素之一，對植物生長發育以及代謝起重要作用。研究表明,氮素可以影響植物類黃酮物質的合成[5]，并以多種方式參與植物體內各種代謝過程，對增進作物生長發育及品質有著明顯作用[6]。【前人研究進展】Kovacik和Klejdus[7]對洋甘菊的研究發現，施用銨態氮可以顯著促進洋甘菊綠原酸的積累，增強酚酸物質代謝。李志元等[8]研究表明，不施和少施銨態氮有利于雪菊的可溶性糖、總黃酮以及綠原酸的積累。張朋等[9-10]研究表明，增加施用硝態氮比例有利于提高杭白菊的根、莖、葉及花中總黃酮和綠原酸的含量。劉偉等[11]研究發現，全生育期缺氮比生殖期缺氮更有利于菊花根、葉及花中黃酮類化合物的積累。【本研究切入點】氮對植物生長代謝的影響不僅與氮素形態、植物種類有關，在植物不同生育期的影響也不盡相同。目前，硝態氮對雪菊幼苗生長及代謝影響的研究未見報道。研究硝態氮對雪菊幼苗生長及代謝產物的影響。【擬解決的關鍵問題】篩選出適宜雪菊幼苗生長的硝態氮肥施用量，為建立雪菊更加合理的施肥體系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗于2019年3～5月在新疆農業大學植物工廠工程技術研究中心的室內外進行，測定項目在新疆農業大學林學與園藝學院實驗室進行。

供試種子采自新疆和田地區皮山縣克里陽鄉，選取籽粒飽滿、大小一致的雪菊種子作為播種材料。

供試肥料為硝酸鈣、過磷酸鈣、硫酸鉀(天津市致遠化學試劑有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 盆栽試驗設計

試驗采用隨機區組設計，設置6個處理，每個處理15盆，重復3次，共計270盆。

當幼苗在穴盤中長至4～6片葉時，定植，定制盆為聚乙烯塑料盆(上下口徑分別為15 cm、13 cm，高為18 cm)，每盆定植1株幼苗。

供試土壤為明珠花卉市場購買的營養土，裝盆前使用多菌靈進行消毒，土壤農化性狀委托新疆農業科學院農業農村部農產品質量監督檢驗測試中心測定。表1

盆中氮、磷、鉀肥均作基肥一次性施入。另外每盆基施8g白云石來調節土壤pH值和補充鈣、鎂營養；同時每盆基施5mL 霍格蘭微量元素混合液以補充土壤微量營養元素[11]。表2

表1 供試土壤農化性狀

Table 1 Basic physical and chemical properties of the soil used

項目Project有機質Organicmatter(g/kg)全氮Totalnitrogen(g/kg)水解性氮Hydrolyzablenitrogen(mg/kg)速效磷Availablephosphorus(mg/kg)速效鉀Availablepotassium(mg/kg)pH含量Content218.48.18778.83253645.78

表2 硝態氮肥試驗設計

Table 2 Design of nitrate nitrogen fertilizer test

處理TrentmentN(g/kg)Ca(NO3)2·4H2O(g/basin)K(g/kg)K2SO4(g/basin)P(g/kg)Ca(H2PO4)2(g/basin)霍格蘭Hoagland(mL/basin)白云石Dolomite(g/basin)CK000.200.740.200.6658N10.101.680.200.740.200.6658N20.152.520.200.740.200.6658N30.203.360.200.740.200.6658N40.254.200.200.740.200.6658N50.305.040.200.740.200.6658

1.2.2 播種、育苗、移栽和緩苗

播種時間為2019年3月1日，采用72孔的育苗盤，育苗盤用多菌靈消毒后每穴播種3～5粒均勻、飽滿、無病蟲害的雪菊種子，輕輕覆蓋0.5 cm厚基質。基質配比為草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1，并用多菌靈消毒后使用。出苗1周后進行間苗，待幼苗長至4～6片葉時，選取大小一致，長勢較好的雪菊幼苗進行移栽。于3月25日進行裝盆移栽，移栽后在溫室里緩苗6 d，4月1日移至室外，此后室外栽培。

1.2.3 生長指標測定

2019年4月28日測定雪菊幼苗的各項生長指標，每個處理選取9株長勢均勻一致的雪菊苗進行測定。包括株高、莖粗、鮮重、根冠比、根長、幼苗分枝數(分支含3片以上進行統計)、葉片SPAD值(每個植株隨機選取位置相近的3片植株上部葉片，利用SPAD502葉綠素儀測定葉片葉綠素含量并計算其平均值)。

1.2.4 品質測定

鮮樣處理：取雪菊幼苗相同部位的葉片(頂端向下3～5葉處)，于液氮中保存，待測。

干樣處理：取雪菊幼苗相同部位的葉片和根，分別用烘箱(105℃，30 min)殺青，60℃烘干；將烘干樣品粉碎研磨后用封口袋低溫保存，待測。

乙醇浸提：準確稱取0.500 g雪菊葉和根粉末于帶塞三角瓶中，加入70%乙醇25 mL，浸泡24 h后，超聲浸提30 min，然后過濾到50 mL容量瓶中，濾渣再超聲浸提一次，過濾到原容量瓶中，反復漂洗三角瓶及殘渣，最后定容到50 mL，然后放入冰箱，-20℃冷藏保存，待測[6]。

可溶性糖測定：稱取葉片處理干樣50 mg放入試管，加入15 mL蒸餾水，沸水浴20 min，過濾入100 mL容量瓶中，反復沖洗殘渣，定容至刻度。吸取提取液1 mL，加入5 mL蒽酮試劑，搖勻，沸水浴10 min取出冷卻，在620 nm波長處測定各溶液的吸光度，代入標準曲線，可求得可溶性糖含量[12]。

可溶性蛋白測定：稱取0.2 g葉片處理干樣，用5 mL蒸餾水研磨成勻漿后，以8 000 r/min離心10 min，取上清液定容至50 mL。吸取提取液1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍試劑，搖勻，放置5 min在595 nm波長處測定各溶液的吸光度，代入標準曲線，可求得可溶性蛋白含量[12]。

總黃酮含量測定：吸取乙醇提取液1 mL，置于25 mL比容量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻放置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL,搖勻放置6 min，加1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置10 min后在512 nm波長處測定吸光度，代入標準曲線，可求得黃酮的含量[13]。

綠原酸含量測定：將乙醇提取液稀釋5倍后吸取1 mL到10 mL試管中，加70%乙醇定容到l0 mL，搖勻，在328 nm波長處測定各溶液的吸光度，代入標準曲線，可求得綠原酸含量[14]。

1.2.5 PAL酶活性測定

PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性測定：參照Koukol和Corm的方法，采用索萊寶公司生產的PAL酶活性測定試劑盒進行PAL活性測定。稱取葉片鮮樣0.100 g，加入1 mL酶提取液，冰浴研磨成勻漿，轉移到離心管中，10 000 g，4℃離心10 min，取上清液，置于冰上待測。按照試劑盒說明加入反應試劑，30℃水浴30 min后，加入終止反應試劑，靜止10 min后，用對照管調零，在290 nm波長處記錄測定管吸光值，代入公式可求得PAL酶活性[15]。

1.3 數據處理

利用Excel 2010軟件對數據進行整理和作圖，采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進行方差分析及顯著性差異比較。

2 結果與分析

2.1 不同硝態氮處理對雪菊幼苗生長的影響

研究表明,施硝態氮對雪菊幼苗株高、莖粗、鮮重均有促進作用，與CK相比，株高、莖粗、鮮重均高于CK。N4、N5處理的株高、莖粗與CK存在極顯著差異；不同處理的鮮重與CK均存在極顯著差異，但N1、N2、N3處理之間無明顯差異。N4處理的株高達到最大值，為7.26 cm；N5處理的莖粗與鮮重最大，分別為0.40 cm、4.00 g。施硝態氮對雪菊幼苗的根冠比及根長具有一定的抑制作用，不同處理的根冠比與CK存在顯著差異，除N2處理外，其他處理達到了極顯著差異；除了N1處理，其他處理的根長與CK存在極顯著差異；N3處理的根冠比值最小，為0.38；N5處理的根長值最小，為12.14 cm。施硝態氮有利于雪菊幼苗地上部分的生長，而不施或少施硝態氮對根的生長具有一定的促進作用。表3

表3 不同硝態氮處理下雪菊幼苗生長變化Table 3 Effect of nitrate nitrogen treatment on the growth ofCoreopsistinctoriaseedlings

處理Treatment株高Plantheight(cm)莖粗Stemdiameter(cm)鮮重Freshweight(g)根冠比Root-shootratio根長Rootlength(cm)CK6.01±0.10Bb0.28±0.01Bb1.54±0.05Dd0.52±0.06Aa13.82±0.25AaN16.11±0.05Bb0.30±0.03Bb2.20±0.12Cc0.40±0.02Bb13.70±0.21AaN26.02±0.10Bb0.31±0,02Bb2.12±0.19Cc0.44±0.03ABb12.45±0.14CcN36.04±0.11Bb0.31±0.02Bb2.02±0.15Cc0.38±0.04Bb13.09±0.20BbN47.26±0.16Aa0.37±0.02Aa3.17±0.31Bb0.41±0.03Bb12.51±0.13CcN57.18±0.23Aa0.40±0.02Aa4.00±0.18Aa0.40±0.05Bb12.41±0.20Cc

注:同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同

Note:Different lowercase letters after the same column data indicate significant difference (P<0.05),and different uppercase letters indicate that the difference is extremely significant (P<0.01),the same below

2.2 不同硝態氮處理對雪菊幼苗分枝數和SPAD值的影響

研究表明,施硝態氮對雪菊幼苗分枝數和SPAD值均有促進作用，幼苗分枝數和SPAD值與CK相比均高于CK。除N3處理外，其他處理的幼苗分枝數與CK存在顯著差異，N1、N4、N5處理與CK達到了極顯著差異；N5處理的SPAD值與CK存在極顯著差異。N5處理的幼苗分枝數和SPAD值達到了最大，分別為9.11和48.92。施硝態氮有利于促進雪菊幼苗分枝和提高葉綠素含量。表4

表4 不同硝態氮處理下雪菊幼苗分枝數和SPAD值變化

Table 4 Effect of nitrate nitrogen treatment on branching number and SPAD value ofCoreopsistinctoriaseedlings

處理Treatment分枝數Numberofbranching葉綠素含量(SPAD值)Chlorophyllcontent(SPADvalue)CK7.56±0.20Cc44.67±0.74BbN18.33±0.33ABb46.67±1.55ABabN28.23±0.51ABCb46.82±1.30ABabN38.11±0.19BCbc45.11±1.23ABbN49.00±0.33ABa46.47±1.63ABabN59.11±0.38Aa48.92±1.73Aa

2.3 不同硝態氮處理對雪菊幼苗代謝產物的影響

2.3.1 可溶性糖

研究表明,與CK相比，各處理葉片中可溶性糖含量略高于CK，但各處理與CK相比無明顯差異。N4處理可溶性糖含量達到了最大，為32.63%，與CK相比增加17.33%。試驗表明施硝態氮對雪菊幼苗葉片中可溶性糖含量具有一定促進作用。表5

2.3.2 可溶性蛋白

研究表明,隨著硝態氮處理濃度的增加，雪菊幼苗葉片中可溶性蛋白含量均高于CK且基本呈現上升趨勢，各處理與CK相比達到了極顯著差異。N5處理可溶性蛋白含量達到了最大，為8.86 mg/g，與CK相比增加51.97%。施硝態氮對雪菊幼苗葉片中可溶性蛋白含量具有顯著促進作用。表5

表5 不同硝態氮處理下雪菊幼苗可溶性糖與可溶性蛋白變化

Table 5 Effect of nitrate nitrogen treatment on soluble sugar and soluble protein inCoreopsistinctoriaseedlings

處理Treatment可溶性糖Solublesugarcontent(%)可溶性蛋白Solubleproteincontent(mg/g)CK27.81±0.76Aa5.83±0.19CcN131.22±0.87Aa7.81±0.39BbN230.50±3.69Aa8.31±0.42ABabN329.52±1.86Aa8.20±0.41ABabN432.63±2.08Aa8.73±0.27AaN530.14±3.03Aa8.86±0.43Aa

2.3.3 總黃酮含量

研究表明,與CK相比，各處理葉片和根中總黃酮均低于CK，且葉片中黃酮下降較為明顯。各處理葉片中黃酮含量與CK存在極顯著差異，除N1處理外，根中黃酮含量與CK存在顯著差異，N3、N4、N5處理達到了極顯著差異。N3處理葉片中黃酮含量最小，為69.75 mg/g，與CK相比下降23.10%。N5處理根中黃酮含量最小，為27.23 mg/g，與CK相比下降21.68%。施硝態氮對雪菊幼苗葉片及根中黃酮含量具有顯著抑制作用。表6

2.3.4 綠原酸含量

研究表明,與CK相比，各處理葉片中綠原酸含量均低于CK且基本呈現下降趨勢，除N1處理外，其他處理與CK存在極顯著差異。N5處理葉片中綠原酸含量最小，為8.55 mg/g，與CK相比下降21.20%。施硝態氮對雪菊幼苗葉片中綠原酸含量具有抑制作用，且施氮量越大抑制作用越明顯。表6

表6 不同硝態氮處理下雪菊幼苗總黃酮與綠原酸變化

Table 6 Effect of nitrate nitrogen treatment on total flavonoids and chlorogenic acid inCoreopsistinctoriaseedlings

處理Treatment葉中總黃酮Totalflavonoidsinleaves(mg/g)根中總黃酮Totalflavonoidsinroot(mg/g)綠原酸Chlorogenicacid(mg/g)CK90.70±2.02Aa34.77±1.22Aa10.85±0.63AaN181.37±2.25Bb32.95±1.82ABab9.77±0.45ABabN279.28±2.31Bb31.56±1.35ABbc9.15±0.23BbcN369.75±3.72Cc29.69±1.89BCcd8.95±0.60BbcN479.15±3.11Bb29.55±0.67BCcd9.12±0.80BbcN578.03±3.98Bb27.23±0.85Cd8.55±0.77Bc

2.4 不同硝態氮處理對雪菊幼苗PAL活性的影響

植物的代謝分為初生代謝和次生代謝，其中植物的次生代謝有多條途徑，苯丙烷類代謝途徑是黃酮類化合物的合成代謝必經的途徑。其中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL) 是這一途徑中的3個關鍵酶，其活性直接影響到產物的合成數量[16]。苯丙氨酸解氨酶是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶，也是苯丙烷類代謝途徑中研究最多的酶。圖1

圖1 硝態氮處理下雪菊幼苗葉片PAL活性變化

Fig.1 Effect of nitrate nitrogen treatment on PAL activity in leaves ofCoreopsistinctoriaseedlings

與CK相比，各處理葉片的PAL活性均低于CK，N4、N5處理葉片的PAL活性與CK存在顯著差異，但處理之間沒有明顯差異。N5處理葉片的PAL活性最低，與CK相比下降10.76%。施硝態氮對雪菊幼苗葉片PAL活性具有抑制作用，且施氮量多的抑制作用較為明顯。圖1

3 討 論

氮素作為植物最重要的營養元素之一，對植物的生長的影響較為直觀。研究結果表明，施硝態氮有利于促進雪菊幼苗地上部分生長，對地下部分生長具有一定的抑制作用。N5處理的株高、莖粗、鮮重、幼苗分枝數、葉綠素含量(SPAD值)等表現最佳，這與李志元、姜雅爽等研究結果基本一致[8,17]。Eriession和Vander研究發現，缺氮條件下，植物地上部生長受到抑制，植物加強碳水化合物的運輸到根部，促進根部的生長以獲得有限的限制性營養，從而增加根冠比[18-19]。林文等[20]研究發現，缺氮條件下還會誘發側根及新根的發育。研究結果表明，不施硝態氮有利于雪菊幼苗根冠比和根長的增加。

研究表明，隨著硝態處理濃度的增加雪菊幼苗葉片可溶性蛋白呈現上升趨勢，但對葉片中綠原酸、總黃酮以及根中總黃酮含量表現為抑制作用。這與劉大會等[21]在藥用菊花中的研究結果一致，不施硝態氮葉片中綠原酸、總黃酮以及根中總黃酮含量表現最佳[21]。施硝態氮對雪菊幼苗可溶性糖有一定促進作用，這與謝晉等[22]在烤煙中研究結果一致，試驗N4處理的可溶性糖表現最佳。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，其活性對黃酮、綠原酸等次生代謝的合成有重要影響。試驗研究表明，施硝態氮對PAL活性具有抑制作用，且處理濃度較高的抑制作用較為明顯，這與劉偉等在杭白菊中的研究結果一致[11]，試驗N5處理的PAL活性最低，與CK相比下降了10.76%。

氮素作為植物最重要的營養元素之一，對植物的生長及代謝有重要影響，農業生產中合理施用氮肥是增產增收的重要手段。然而，植物在整個生育期對氮肥的需求并不相同，不同時期的合理施氮更有利于提高作物的產量和品質。雪菊苗期施硝態氮肥，可以提高雪菊幼苗葉片中蛋白質和葉綠素含量，增強其光合作用，促進可溶性糖含量的積累，為生長和代謝提供基礎。但施硝態氮肥對PAL活性具有抑制作用，導致PAL 活性降低，從而影響了黃酮、綠原酸的合成數量的下降。雪菊幼苗期中黃酮、綠原酸等影響品質的代謝產物含量是否影響生殖期雪菊花的品質還有待研究。

4 結 論

雪菊苗期施硝態氮肥，可以提高雪菊幼苗葉片中蛋白質和葉綠素含量，從而增強其光合作用，促進可溶性糖含量的積累，為生長和代謝提供基礎。但施硝態氮肥對PAL活性具有抑制作用，導致PAL 活性降低，從而影響了黃酮、綠原酸合成的數量下降。

N5處理莖粗、鮮重、分枝數、SPAD、可溶性蛋白含量均為最大值，分別為0.40 cm、4.00 g、9.11 、48.92 、8.86 mg/g。N4處理株高和可溶性糖含量為最大值，分別為7.26 cm和32.63%。而根冠比、根長、葉中黃酮、根中黃酮、葉中綠原酸最大值均為CK，分別為0.52、13.82 cm、90.70 mg/g、34.77 mg/g、10.85 mg/g。CK處理中黃酮和綠原酸含量較高，但不施硝態氮肥嚴重限制了雪菊幼苗的生長和干物質積累，CK處理中株高、莖粗、鮮重、分枝數、SPAD、可溶性糖、可溶性蛋白均為最小值，分別為6.01 cm、0.28 cm、1.54 g、7.56、44.67、27.81%、5.83 mg/g。雪菊幼苗期黃酮、綠原酸等影響品質的代謝產物含量是否影響生殖期雪菊花的品質還有待研究，幼苗期生物量的積累是雪菊后期生長發育以及產量形成的保證。硝態氮施用量以N4、N5為宜即0.25 ～0.3 g/kg營養土。